培養基的制備、融化程序的確認及注意事項！

一、培養基的制備 

微生物實驗室所用培養基可按藥典規定檢查方法中所列的培養基配方配制，也可使用復合型的干燥培養基，或是使用已配制且分裝好的成品培養基。干燥培養基是將新鮮配制的液體培養基用不同的方法使水分去掉；或將培養基內的各種固形成分，經過適當的處理，充分混勻，使成干燥的粉末狀。用時只要按比例加入一定量的蒸餾水，經過溶解、分裝、高壓蒸汽滅菌，即可應用。其優點是節省培養基配制時間，攜帶方便，使用簡易，特別使用于一般流動性及設備簡單的小型實驗室。目前，國內外已有多家生產，如法國生物梅里埃公司、美國密理博公司的產品、中國藥品生物制品所監制的產品，其制造方法有下列幾種：噴霧法、真空法、烘干法、蒸發法、球磨法。 

藥品微生物限度檢驗、無菌檢驗、抗生素效價測定、藥敏試驗及其抗菌、防腐等項微生物檢測中，培養基的質量好壞、穩定與否，對檢驗結果有極為重要的影響。但因培養基的配方中各原料成分的理化性能、穩定性不同，致使檢驗結果有較大差異，即使同一廠家生產的同一型號的原料產品，各個批號之間質量都有較大的差異，加上各地實驗室配制培養基的方法不一，同一實驗生長有顯著不同。為此培養基的質量標準十分重要。干燥培養基，使用方便，節約人力、物力、時間，是培養基標準化的必由之路。按說明書要求稱取適量后加水溶解配制，所用培養基質量必須符合藥典規定的靈敏度檢查試驗及無菌性檢查試驗才可用于檢驗。 

配制培養基、緩沖液、試劑等時，稱量要迅速以免吸潮而影響稱量的準確性，同時為避免增加培養基等中的金屬離子及其他微量化學元素而影響微生物的生長、鑒別、所用器具、容器應為潔凈玻璃制品，所用溶解用水應為純水或蒸餾水。加熱溶解時不斷攪拌促進培養基充分溶解，采用直火加熱時易使培養基結底炭化而影響營養度和澄明度，可用沸水浴或隔套蒸鍋通過蒸汽加熱。然后調節pH，按規定的要求分裝，容器封口后用經驗證過的滅菌程序滅菌。滅菌程序的參數應記錄于高壓滅菌柜的使用日志及相應的配制記錄中。注意滅菌后物品應有適當措施防止再次污染。制備某些選擇性培養基或淋洗液需在使用前向培養基中加入β-內酰胺酶等試劑時，務必確保所加入劑的無菌性和質量保證。 

制備好的培養基、緩沖液等應及時抽取適量用于檢查pH、無菌性、靈敏度等質量是否符合規定。微生物檢驗用培養基、緩沖液及試劑的配制應有原始記錄供追溯檢查。所有相關信息包括：名稱、處方原材料、稱量數、稀釋溶解量、滅菌條件、滅菌程序參數，制備日期、制備人簽名、質量檢查結果等，都必須在原始記錄或工作日志上反映出來。 

二、培養基融化程序的確認 

裝于試管瓶內的成品固體培養基，在使用前需將其融化。這一融化過程也同樣需要確認，以保證培養基的營養成分不會因過度加熱而受影響。 

一般培養基應只能進行1次蒸汽滅菌處理，否則，重復高溫加熱會破壞培養基的營養成分。因此，不宜使用蒸汽滅菌柜融化瓊脂培養基，宜選用沸水浴或微波爐融化培養基。因沸水浴的溫度始終控制在100℃以內，相當安全，但對裝量較大的培養基要使融化均勻充分，則加熱的時間較長，微波爐融化培養基具有快速的優點。 

至少選擇3批具有代表性的不同類型培養基，對其融化前后的質量進行對比檢查。確認時，應對不同融化法的運行參數（時間和溫度）予以明確設定，確認合格后，將其寫入相應的標準操作規程中。如果一臺設備可以設定多個參數，建議在其和設定值下分別進行確認試驗，以確定正常的使用范圍。有關抗生素效價分析用培養基的融化過程確認方法，要參照有效期的確認試驗方法進行。  

三、培養基制備應注意事項 

1、常用玻璃儀器的準備 

制備培養基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。 

（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。 

（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。 

（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內160℃干熱滅菌2h后，備用。 

2、培養基的制備及儲存 

（1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應經常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分。 

在使用干燥培養基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養成分被破壞。 

（2）校正酸堿度（調節pH）：培養基必須有適當的pH。因此測定pH是培養基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃。調節pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。當調節緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養基的pH會比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適。因此對培養基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數據考察每種培養基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節。干燥培養基一般已校正過pH，用時也必須再驗證。測定時，一般用指示劑滴入培養基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調整pH后要加熱過濾，使培養基澄清。 

（3）培養基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經校準和確認。每次使用前后，均要對分配器的管道系統進行沖洗，在分裝無菌培養基前，則要采用無菌硅膠管。 

固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管。 

平皿：傾注平皿，應在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養箱 中倒置30—60min。讓水蒸汽自然蒸發。

斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，如沾有培養基應用布抹去，以避免污染。 

高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用。 

分裝好的培養基或緩沖液等及時密封后必須在配制當天（2h內）進行滅菌處理。液體、半固體培養基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 

培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定。普通培養基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應延長至20min。含糖培養基115℃、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、雞蛋等培養基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌。高壓滅菌應嚴格按照操作規程執行，必須逐漸加熱，*排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物。以上的滅菌時間和溫度要經過驗證確認，如不同類型培養基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。 

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