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分子實驗-PCR

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更新時間:2022-12-23 09:04:24瀏覽次數(shù):1143次

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分子實驗-PCR:普通電泳PCR實驗的原理是DNA分子在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同,表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。
  分子實驗普通電泳PCR實驗的原理是DNA分子在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同,表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。
 
  1.試劑
 
  PCR產(chǎn)物,TAE電泳緩沖液,1000x溴化乙錠儲存液,電泳級瓊脂糖,DNA分子量標準
 
  2.實驗準備
 
  配制TAE電泳緩沖液(50x儲存液,pH約8.5: Tris 堿242g 57.1ml冰已酸,37.2g Na2EDTA.2H2O,dd water定容至lL),6x加樣緩沖液(0.25%溴酚藍,40%蔗糖水溶液) ; 1.5ml 離心管裝入鋁制飯|盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。
 
  3.操作步驟
 
  (1)稱取0.4g瓊脂糖粉,放入三角瓶,加入50ml TAE電泳緩沖液(1x),放入微波爐中燒開( lmin)。注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末,待*熔化后停止微波爐(切不可讓膠溶液溢出到微波爐中! )。
 
  (2)戴上線手套,從微波爐中取出三角瓶,置桌面上冷卻致不燙手(約50-60°C)。
 
  (3)把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可,不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠*凝固。(剩 下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用)。
 
  (4)在水平電泳槽中加滿1xTAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm),注意正負電極的位置連接正確。
 
  (5)待膠*凝固后( 15-20分鐘),小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上,凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的側(cè)要朝向電泳槽的負極。
 
  (6)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10μl 的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中(如果需要時,在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ul DNA分子量標準物)。
 
  加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上,用另一只手扶住這只手的手腕,以減少移液器的抖動。看到藍色的樣品吸管尖頭伸進加樣孔后(不能伸得太深,以免穿破凝膠的底部)緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍色樣品流到孔外。
 
  (7)打開電源開關(guān),樣品將形成條藍色的橫帶 向前移動 (如果發(fā)現(xiàn)藍色向后移動,立即關(guān)閉電源,調(diào)換電極)。電泳將進行約30min。
 
  (8)當(dāng)藍色的溴酚藍遷移到距凝膠邊緣1cm時,關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。
 
 

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