英文品名:Mouse C-Peptide ELISA Kit
貨號:90050
廠商品牌:Crystalchem
實驗準備：
1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預(yù)孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
   建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

　　Q3.細胞計數(shù)及存活測試
1、原理：
(1)計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。

　　Q4.細胞特性
在細胞培養(yǎng)之前，我們要了解一下你所要養(yǎng)細胞的基本特性，這點可以從細胞的產(chǎn)品說明書或者從ATCC細胞庫查詢。除此之外我們還要知道每管細胞的數(shù)量，建議分裂或傳代的比例，和已知細胞的傳代代次等信息。

　　Q5.準備培養(yǎng)基
復(fù)蘇細胞時需要準備合適的培養(yǎng)基，血清和細胞生長所需的添加劑。大部分培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)體系，可以在訂購細胞系時獲得。
雖然大多數(shù)細胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，但是當培養(yǎng)基改變時，細胞的性質(zhì)也會變化。因此，使用細胞庫推薦的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞會獲得的效果。

　　Q6.開啟凍存管
1.準備一個培養(yǎng)瓶，加入適宜細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，液體體積按照說明書的推薦配置，并平衡培養(yǎng)基的溫度和pH（CO2）。　
2.在37℃水浴中或細胞的正常生長溫度下將凍存管輕輕搖動。解凍要快，約2分鐘或直到冰晶融化即可。
3.從水浴中取出凍存管并用浸泡或噴灑70%乙醇的方式來消毒。進一步的操作均需在無菌操作臺中嚴格無菌條件下進行。
4.擰開凍存管的管帽并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個含有9 ml推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125×g 10 min）除去冷凍保護劑（DMSO）。棄去上清，并用1或2 ml*培養(yǎng)基重懸細胞。將這些細胞懸液轉(zhuǎn)移到含有*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動以*混勻。
5.培養(yǎng)24小時后檢查細胞狀態(tài)并在需要時進行傳代。

　　Q7. 培養(yǎng)用液pH對細胞生長的影響

　　由于，大多數(shù)細胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。

　　但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。因此，我們在配制培養(yǎng)用液時，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。