氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血液中乙基葡萄糖醛酸苷

目的 ：建立血液中乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide，EtG）的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）測定方法。

方法 血液用于乙腈沉淀蛋白，離心后，將上清液轉(zhuǎn)移吹干，殘留物經(jīng)N,O-雙（*基硅烷基）三氟乙酰胺衍生化，用GC-MS/MS進(jìn)行檢測。結(jié)果 血液中EtG的檢出限為0.05ul/ml，線性范圍為0.1-10ul/ml（r=0.9999）。對送檢案例血液檢材進(jìn)行EtG檢測，效果良好。

結(jié)論 本方法適用于血液中EtG的檢測。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)毒理學(xué)；血液；乙基葡萄糖醛酸苷；氣相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜法

酒后駕車是一個世界性的交通安全問題。我國每年因交通事故死亡中約25%-30%與酒后駕車有關(guān)。由于乙醇在體內(nèi)代謝較快，一般飲酒后6-8h體內(nèi)已檢測不到乙醇。對于疑酒后駕車肇事后逃逸者，在一定時間后體內(nèi)檢測不到乙醇，因此需要尋找新的途徑證明肇事者是否為酒后駕車。

乙醇進(jìn)入人體后，有一部分乙醇與尿嘧啶核苷-5‵-二磷-葡萄糖醛酸結(jié)合成乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide，EtG）由于其比原體乙醇的半衰期長，當(dāng)血液中乙醇濃度低于檢測*，體內(nèi)仍可在一定時間內(nèi)檢出EtG。因此血液中EtG的檢測及評價越來越為人們所重視 ，特別是酒后駕車肇事逃逸案件中，抽血與事故發(fā)生時間隔過長，血液中往往測不出乙醇成分，但可以檢測血液中EtG^{1-2}。

血液中EtG的測定方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用發(fā)（GC-MS）。LC-MS/MS是zui常用的檢測方法^{3-7}。GC-MS測定中雜質(zhì)干擾較多，對樣品前處理要求較高，需要固相萃取，樣品處理時間長^{8-12}，而氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）可以克服這些缺點^{13-14}。

本研究建立了血液用乙腈沉淀蛋白，經(jīng)衍生化后用GC-MS/MS檢測EtG的方法

1 材料與方法：

   1.1 儀器與試劑

           氣相色譜（美國Agilent公司）與串聯(lián)質(zhì)譜（美國Waters公司）聯(lián)用儀，離心機(jī)（美國Eppendorf公司），EtG和EtG-d₅（美國Cerilliant公司），N,O-雙（*基硅烷基）三氟乙酰胺-*基氯硅烷（BSTFA-TMCS,體積比為99：1）（美國Sigma-Aldrich公司），其余試劑均為分析純。

1.2溶液配制

         EtG溶液：將100ug/ml的EtG標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液用甲醇稀釋得20.0ug/ml的EtG工作液。 內(nèi)標(biāo)EtG-d5工作液。

1.3樣品前處理：

取血液0.10ml置于1.5ml離心管中，加入5ul內(nèi)標(biāo)EtG-d₅工作液和0.90ml乙腈，渦旋混合，以離子半徑6cm，10000r/min，離心5min，轉(zhuǎn)移上清液另一離心管中，6cm，10000r/min，離心5min，轉(zhuǎn)移上清液另一離心管中，60℃水浴中空氣流下吹干，殘留物中加入BSTFA-TMCS（66ul）和吡啶（33ul），90℃干燥箱中進(jìn)行衍生化反應(yīng)30min，取出。冷卻后1ul進(jìn)樣。

1.4儀器分析：

1.4.1氣相色譜柱條件

         色譜柱：HP-1MS毛細(xì)管柱（30mX0.25mm,0.1um）。柱溫：初溫100℃保持1min，以8℃/min程序升溫205℃，再以30℃/min程序升溫280℃保持3min。進(jìn)樣口溫度： 250℃。分流比為10：1.載氣：氦氣，流速為1ml/min。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源（EI源）溫度220℃，接口溫度300℃，碰撞氣為氬氣。正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，MRM定性離子對：EtG 為261>143（CE=5）,261>73（CE=20）;EtG-d₅為266>143（CE=5）,266>73（CE=20）;以261>143（EtG）和266>143（EtG-d₅）作為定量離子對。

2  案例應(yīng)用：

   某司機(jī)于某日上午7：00許發(fā)生交通事故后，駕車逃離現(xiàn)場，當(dāng)日晚21：00許投案。靜脈抽血送檢，其時距交通肇事時間為14h，結(jié)果未檢出乙醇成分。應(yīng)用本方法分析，結(jié)果檢出EtG成分，為委托單位辦案提供了有力的證據(jù)。

3   結(jié)論

        本方法建立了一種有機(jī)溶劑沉淀蛋白，經(jīng)衍生化后，用GC-MS/MS檢測血液中EtG的方法，并成功應(yīng)用于案例。該方法簡便、快速，適用于實際檢案工作。