多重熒光免疫組化技術(Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也稱作酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術，是一類利用辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。
該方法基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術，允許同時檢測單個細胞或組織樣本上的多個目標靶點，全面研究細胞組成、細胞功能和細胞間相互作用。
Tips：原理：帶有染料標記的底物酪胺 (T) 分子在過氧化氫氧化環境下，被抗體或探針固定的 HRP 轉化為具有短暫活性的中間狀態 (T*)，然后被激活的中間態分子 (T*) 迅速與相接蛋白分子的富含電子區域 (酪氨酸殘基) 進行穩定的共價結合，未被標記的酪胺分子將被洗脫，借此實現對抗原的特異性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP，抗體，目標抗原) 都含有大量的酪氨酸結合位點，所以目標抗原處會富集大量標記分子，使信號被有效放大 (圖 2)。
■ IHC 與 mIHC
：簡單來說，mIHC 屬于 IHC 的升級版本！
Tips：2. 常規免疫組化受傳統染色成像的限制，靶標少于 3 個，無法完整分析組分信息。而多重熒光免疫組化可實現多因子共定位，可以獲取更多的生物信息，且樣本需求量較少。
圖 4. 癌組織單色 IHC（上）和多色譜 mIHC（下）驗證[3]
■ mIHC 與 IF
那么問題來了，mIHC 與 IF 又有什么區別呢？既然最后的成像都是熒光圖像，那按照 IF 實驗就行哇，為什么要去做 mIHC 呢？？？
：其實，mIHC 作為一種新型的免疫化學技術，其價值自然會優于傳統的 IF 實驗，并且二者在原理及操作步驟上均有差異。
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圖 3. mIHC（左）和常規三色熒光檢測示意圖（右）
■ 應用一：腫瘤機制探究
Gang Wei 等人收集了透明細胞腎細胞癌 (ccRCC) 患者的腎周脂肪 (Perinephric adipose tissue, PAT) 和皮下白色脂肪 ( White adipose tissue,WAT) 組織樣本，發現腫瘤鄰近脂肪細胞的解偶聯蛋白 1 (Uncoupling protein 1, UCP1) 表達高于遠端脂肪細胞（WAT 褐變的典型特征之一是 UCP1 的表達上調）。
此外，腫瘤細胞的 qRT-PCR、mIHC 檢測和免疫印跡均表明，在聯合注射 BAC-shPgc1a或 BAC-shUcp1 相關的腫瘤中，脂肪細胞促進的 UCP1 水平上調被抑制(圖 4)。
進一步的研究發現，ccRCC 細胞分泌甲狀旁腺激素相關蛋白 PTHrP 以通過 PKA 激活促進 PAT 褐變，而 PAT 介導的產熱導致過量乳酸的釋放以增強 ccRCC 的生長、侵襲和轉移色[2]。
圖 4. UCP1 水平變化的檢測[4]
mIHC (A), qRT-PCR (BG) and Immunoblotting (C) 檢測 UCP1 水平。空白對照組：786-O; 陰性對照組：786-O+BAC-Scramble；敲低 Pgc1a 實驗組：786-O+ BAC-shPgc1a；敲低Ucp1實驗組：786-O+ BAC-shUcp1。
■ 應用二：免疫抑制性腫瘤微環境鑒定
貨號 | 產品名稱 | Ex/Em (nm) |
HY-D1838 | Vari Fluor 350 TSA（200×） | 347/448 |
HY-D1837 | Vari Fluor 488 TSA（200×） | 490/515 |
HY-D1832 | Vari Fluor 532 TSA（200×） | 527/558 |
HY-D1836 | Vari Fluor 555 TSA（200×） | 555/565 |
HY-D1835 | Vari Fluor 594 TSA（200×） | 590/617 |
HY-D1834 | Vari Fluor 640 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1831 | Vari Fluor 620 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1833 | Vari Fluor 680 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1839 | Biotin TSA（200×） | / |
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參考文獻
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