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應用案例（質量光度計）：質量光度計在核酸方面的應用
應用案例（質量光度計）：質量光度計在核酸方面的應用
Mass photometry of nucleic acids
翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
質量光度法可以定量測定溶液中生物分子的質量分布。它用于分析蛋白質的純度，表征他們的低聚態和定量他們的蛋白質-蛋白質相互作用是建立的。然而，它在表征其他生物分子(包括核酸)方面的應用研究較少。在這里，我們展示了如何使用質量光度法來測量100到5000個堿基對范圍內的DNA的質量、大小和豐度。
質量光度法(MP)是一種新的分析技術，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質量。在MP測量中，當分子遇到質量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質量成線性關系。因此，通過一個簡單的校準，不同種類分子的分子質量可以被精確地確定。
在這篇應用筆記中，我們概述了如何應用MP測量核酸，包括制備和校準的步驟。我們還展示了從低質量階梯到整個質粒的DNA測量示例。
核酸測量的準備工作
DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現出很少和短暫的結合。這導致MP數據中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。
為了克服這種瞬態行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。
用鎖相環覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結合事件的數量顯著增加(解除結合的數量減少)(圖1)。低質量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa 到1242 kDa)。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質量分布。
核酸質量校準
質量光度法(MP)是一種新的分析技術，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質量。在MP測量中，當分子遇到質量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質量成線性關系。因此，通過一個簡單的校準，不同種類分子的分子質量可以被精確地確定。
在這篇應用筆記中，我們概述了如何應用MP測量核酸，包括制備和校準的步驟。我們還展示了從低質量階梯到整個質粒的dna測量示例。
核酸測量的準備工作
DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現出很少和短暫的結合。這導致MP數據中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。
圖1未處理與功能化玻璃上核酸的測量值。DNA階梯疊加在未處理(中藍色)和聚賴氨酸涂層(灰色/深藍色)玻璃上。分子質量(kDa)采用DNA校準，假設一個堿基對等于660 Da。
為了克服這種瞬態行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。
用鎖相環覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結合事件的數量顯著增加(解除結合的數量減少)(圖1)。低質量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa)
1242 kDa)是很好的解決。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質量分布。
核酸質量校準
圖2 DNA與蛋白質校準比較。不同的核苷酸和氨基酸折射率導致不同的DNA和蛋白質校準曲線的斜率。這并不影響測量，但影響分析物分子質量的計算。
MP可應用于多種生物分子。然而，不同類型的分子的折射率不同。因此，為了正確地將測量的對比與分子質量相關聯，應該使用已知質量和與分析物相同分子類別的分子進行適當的校準。對不同分子類別的標定均顯示出對比度和質量之間普遍的線性相關關系，但斜率不同(圖2)。
至于校準蛋白質的測量，可用的商業標準可用于校準DNA的測量。凝膠電泳的DNA階梯(1堿基對= 660道爾頓)的一次測量就足以進行準確的校準(圖2)。通過這些簡單的準備，MP可以用來測量未知成分的DNA樣品的質量(或堿基對的數量)。
測量核酸
為了證明MP測量對核酸的實用性，我們使用最小樣本(3 ng)確定了PCR產物的質量和均勻性。測量結果顯示，在218 kDa處有一個對稱峰，相當于331 bp(圖3)，與預期長度335 bp接近。
圖3 PCR產物驗證結果顯示其同源性。PCR產物的MP測定得到了分子量為218 kDa的單峰。用DNA標準曲線進行校正，長度為331 bp(預期長度為335 bp)。
為了測試更大的DNA物種是否能夠以同樣的精度進行分析，我們測量了質粒pUC18(圖4)。在2683 bp處觀察到豐富的峰，相當于1773 kDa。檢測到的DNA片段長度約為5000 bp，短于1000 bp。
圖4質粒的驗證顯示了質粒的異質性。質粒pUC18的MP測定顯示一個主峰，分子量為1773 kDa。使用DNA標準曲線進行校正，結果顯示完整質粒的長度為2683 bp(預期長度: 2686bp)。同時檢測到高、低質量的DNA種類。
這種測量突出了MP適用的寬質量范圍，以及測量的單分子性質所提供的高動態范圍。
綜上所述，MP是一種令人興奮的替代現有核酸定量技術。它允許使用非常少的樣品進行質量測定和純度評估，只需幾分鐘，并且不需要任何污漬。
北京佰司特科技有限責任公司
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