緊湊型細(xì)胞沉降器

我們現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出這種成熟技術(shù)的更緊湊、更高效的放大版本，并為其中四種新穎的設(shè)計(jì)申請(qǐng)了專li。

使用這些更高效、更緊湊的設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的強(qiáng)大傾斜沉降器技術(shù)現(xiàn)在也可以適用于從重組微生物酵母細(xì)胞中生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。

這張照片顯示了一個(gè)實(shí)驗(yàn)室/中試規(guī)模的細(xì)胞保留裝置（左側(cè)）連接到一個(gè) 5 升生物反應(yīng)器，在高細(xì)胞密度灌注操作中連續(xù)培養(yǎng)酵母畢赤酵母細(xì)胞數(shù)周。

所示的較小裝置（右側(cè)）預(yù)計(jì)可從 5 升哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中產(chǎn)生約 5 vvd 澄清的收獲流，其中僅包含死細(xì)胞和細(xì)胞碎片以及分泌產(chǎn)物。

我們正在申請(qǐng)專li的內(nèi)部沉降表面使其成為一個(gè)強(qiáng)大和緊湊的細(xì)胞分離裝置，通過(guò)收獲流選擇性地去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，并將活細(xì)胞和生產(chǎn)細(xì)胞完回收回灌注生物反應(yīng)器。

使用新型 Compact Cell Settler 原型對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)

我們?cè)谛略O(shè)計(jì)的新型緊湊型細(xì)胞沉降器中大大增加了傾斜沉降器表面，其占地面積與 CS-10 相同。

因此，我們能夠以超過(guò) 5 升/天的更高灌注流速?gòu)纳L(zhǎng)酵母畢赤酵母細(xì)胞的 5 升灌注生物反應(yīng)器中獲得澄清的收獲，超過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中每天 1 體積交換的典型灌注率。

如圖所示，生物反應(yīng)器 OD600 保持在 700 以上超過(guò) 2 個(gè)月。生物反應(yīng)器 OD 從 200 小時(shí)到 1000 小時(shí)的小波動(dòng)是由于我們對(duì)灌注速率和進(jìn)料甘油濃度的操作。

沉降器頂部流出物或收獲物澄清，其 OD600 大多在 10 和 30 之間，代表生物反應(yīng)器中酵母細(xì)胞的不到 5%。

基于更大尺寸的 CHO 細(xì)胞，預(yù)計(jì)這種相同尺寸的沉降器（直徑 12 英寸，如上一頁(yè)底部照片所示）每天能夠從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得超過(guò) 250 升的澄清收獲物。

與重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)相比，從灌注生物反應(yīng)器中收獲的產(chǎn)品更高

在開(kāi)始灌注之前的初始補(bǔ)料分批操作期間，分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在生物反應(yīng)器中積累至 >1.5 g/L 的滴度。灌注開(kāi)始后，生物反應(yīng)器中的蛋白質(zhì)滴度由于

連續(xù)收獲到流出物中并被新鮮培養(yǎng)基稀釋而降低。

從 200 小時(shí)到 1000 小時(shí)，蛋白質(zhì)滴度保持相對(duì)恒定，而灌注率大約為 2 升/天左右。隨著灌注率在灌注生物反應(yīng)器運(yùn)行的兩個(gè)月內(nèi)逐漸增加，特別是在 1000 小時(shí)后，

由于收獲和稀釋率增加，蛋白質(zhì)滴度略有下降。

然而，與較低灌注率下的早期值相比，收獲罐中蛋白質(zhì)積累的速率（灌注率和蛋白質(zhì)滴度的產(chǎn)物）在較高灌注率下增加得更快。在兩個(gè)月長(zhǎng)的灌注操作中，

從這個(gè)以逐漸增加的灌注速率操作的 5 升生物反應(yīng)器中積累的蛋白質(zhì)收獲量為 160 g。

這個(gè)數(shù)量比在相同的兩個(gè)月期間從相同的 5 升生物反應(yīng)器中進(jìn)行大約 8 次重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)操作的澄清上清液中收獲的數(shù)量高出 4 倍以上。

Compact Cell Settlers 更適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高細(xì)胞密度灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)

不銹鋼緊湊型細(xì)胞沉降器可用于在哺乳動(dòng)物（例如 CHO）細(xì)胞的連續(xù)灌注培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度和高活力。在這張照片中，我們展示了一個(gè)典型的 6

英寸直徑緊湊型沉降器與連續(xù)灌注生物反應(yīng)器的連接，該反應(yīng)器用于培養(yǎng) CHO 細(xì)胞超過(guò)兩周。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞大于 10 微米，并且比酵母細(xì)胞大，因此我們需要比酵母細(xì)胞更小的緊湊型定居器。

來(lái)自生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)蠕動(dòng)泵通過(guò)水平端口（隱藏在前景中帶有 Sudhin Biopharma Co. 徽標(biāo)的不銹鋼沉降器后面）泵入沉降器中。沉降的 CHO

細(xì)胞通過(guò)蠕動(dòng)泵從底部端口返回到生物反應(yīng)器中。沉降器頂部端口的流量只是蠕動(dòng)泵控制的兩個(gè)流量之間的差異：1. 來(lái)自生物反應(yīng)器的入口流量和 2. 從沉降器到生物反應(yīng)器的返回流量。

可以從沉降器頂部流出流和沉降器底部返回流中取樣，以測(cè)量每個(gè)流中的細(xì)胞濃度和活力。我們還可以測(cè)量這兩個(gè)樣品以及生物反應(yīng)器中細(xì)胞的大小分布，

以分析緊湊型細(xì)胞沉降器在選擇性地僅去除沉降器頂部流出物中的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片方面的性能。

緊湊型細(xì)胞沉淀器選擇性地去除沉淀器頂部流出物中較小的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，但不會(huì)去除較大的活細(xì)胞。

在我們?cè)缙诘牟溉閯?dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)之一中，由于使用了有毒的消泡劑，我們?cè)谏锓磻?yīng)器中的細(xì)胞活力較低 (~50%)。由于生物反應(yīng)器中的這種低細(xì)胞活力，

我們?nèi)硬y(cè)量了生物反應(yīng)器樣品中細(xì)胞的大小分布。我們可以在 8 到 10 微米的尺寸范圍內(nèi)看到可識(shí)別的死細(xì)胞峰，以及較小尺寸范圍內(nèi)的大細(xì)胞碎片尾巴。

當(dāng)這種低活力細(xì)胞被泵入 6 英寸直徑的緊湊型細(xì)胞沉降器時(shí)，沉降器頂部流出物僅包含那些未在沉降器內(nèi)沉降并在底部端口移除的細(xì)胞。

來(lái)自沉降器頂部流出物流的樣品顯示尺寸范圍為 8 – 10 微米的較大死細(xì)胞峰和較小尺寸范圍內(nèi)的細(xì)胞碎片尾部。這些數(shù)據(jù)有力地表明，

我們的緊湊型細(xì)胞沉降器只能選擇性地去除較小的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。更重要的是，頂部流出物含有少的 15-30 微米尺寸范圍內(nèi)的活細(xì)胞。

這種選擇性去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片是我們的緊湊型細(xì)胞沉降器（以及我們之前的傾斜層狀沉降器）的特之處，這是其他任何細(xì)胞保留設(shè)備所沒(méi)有的，

例如那些使用膜、離心機(jī)或聲學(xué)共振的設(shè)備誘捕方法。現(xiàn)在，憑借我們正在申請(qǐng)專li的緊湊型細(xì)胞沉降器，我們提供了與傾斜沉降器相同的選擇性去除死細(xì)胞的方法，

而且占地面積小得多（1/6）。

新型緊湊型細(xì)胞沉降器

緊湊型沉降器作為哺乳動(dòng)物 (CHO) 細(xì)胞灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)的選擇性細(xì)胞保留裝置可實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度

在我們隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谏锓磻?yīng)器運(yùn)行的兩周內(nèi)，使用緊湊型細(xì)胞沉降器作為連接到生物反應(yīng)器的選擇性細(xì)胞保留裝置，以相對(duì)大約 500 毫升/天的低灌注流量。

由于通過(guò)沉降器頂部流出物流選擇性去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，生物反應(yīng)器中細(xì)胞的存活率百分比保持高，或從十天內(nèi)的約 80% 的值顯著增加到兩周內(nèi)的約 90%。

在前兩周補(bǔ)料頁(yè)面培養(yǎng)物中存活率百分比的典型下降是單調(diào)的，或者由于補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器中死細(xì)胞的積累而根本無(wú)法逆轉(zhuǎn)。

隨著培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)到三周，我們的灌注生物反應(yīng)器的存活率百分比觀察到增加是使用沉降器（緊湊型或傾斜型）作為選擇性細(xì)胞保留裝置的一個(gè)特特征，

但在任何其他使用膜的總細(xì)胞保留裝置中沒(méi)有看到、離心機(jī)或聲學(xué)捕獲室。

選擇性去除沉降器頂部流出物中的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，幾乎完將活細(xì)胞從沉降器底部返回到生物反應(yīng)器

三個(gè)流的尺寸分布測(cè)量，1. 從生物反應(yīng)器到沉降器的入口流，2. 沉降器頂部流出物/收獲流和 3. 沉降器底部返回生物反應(yīng)器可重復(fù)地表明 (a)

沉降器頂部流出物或收獲流包含只有死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，但不含任何活細(xì)胞和生產(chǎn)細(xì)胞，并且 (b) 沉降器底部回流包含幾乎所有從生物反應(yīng)器進(jìn)入沉降器的活細(xì)胞和生產(chǎn)細(xì)胞。

來(lái)自臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定的其他數(shù)據(jù)（此處未顯示）證實(shí)，沉降器底部回流中的細(xì)胞活力通常與生物反應(yīng)器中的細(xì)胞活力相同，并且通常略高于生物反應(yīng)器入口流中的細(xì)胞活力。

此外，留在沉降器頂部流出物中的細(xì)胞的活力低，證實(shí)大部分死細(xì)胞和細(xì)胞碎片留在流出物/收獲流中。與生物反應(yīng)器和沉降器底部回流中的活細(xì)胞數(shù)量相比，

收獲流中的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片數(shù)量大大減少（數(shù)個(gè)對(duì)數(shù)）。

緊湊型細(xì)胞沉降器