在成人肌細胞收縮中的應用

該系統被理想化和開發以消除光學邊緣檢測和分割方法的局限性，例如在成人 CM 的采集過程中對適當的細胞對齊和細胞旋轉的要求（Delbridge 和 Roos，1997 年；Ren 和 Wold ， 2001年） . 為了測試我們方法的有效性和敏感性，我們將細胞暴露于對收縮參數有明確影響的藥物。成人 CM 接受異丙腎上腺素 (ISO) (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米(VERA) (100 nmol L -1). 異丙腎上腺素是一種 β-腎上腺素能激動劑，通過增加平均速度和縮短長度的程度顯著增強 CM 收縮力，從而減少收縮和松弛所需的時間（Butler 等人，2015 年；Harmer 等人，2012年）。維拉帕米是一種鈣通道阻滯劑，廣泛用于治療心律失常（Bourgonje 等人，2013 年），同時也是一種抗高血壓藥，因為它在心臟系統中具有負性肌力和變時作用（Harmer 等人，2012 年；斯特恩等人，1986 年）。圖 4Ai-ii 分別顯示了樣本空間圖像和平均速度軌跡，這些記錄是從以 1 Hz 刺激并用異丙腎上腺素或維拉帕米處理 60 秒的細胞記錄的。圖 4 Aiii 顯示了從一個收縮-松弛周期獲得的一條平均速度軌跡的放大視圖。圖 4 B–4D顯示了來自三個立實驗的異丙腎上腺素和維拉帕米對成人 CM 收縮參數影響的濃度響應分析。如圖4 B所示，ISO 和 VERA 都減少了收縮和松弛時間，對松弛時間的影響更顯著。此外，ISO 增加了大收縮和松弛速度（圖 4 C）并縮短了面積（圖 4D) 成人 CM 的濃度依賴性方式。當用 VERA 處理細胞時，觀察到相反的效果（圖 4C和 4D）。表 S1列出了用不同濃度的 ISO 和 VERA 處理的成人 CM 獲得的所有收縮參數。值得注意的是，數據分析不需要用戶操作圖像，因為軟件可以處理實驗生成的整個圖像。

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圖 4。小鼠和 TGR-mREN2-27 大鼠成人 CM 收縮效應的收縮波運動和圖形檢測

(A) (i) 在大收縮速度 (MCS) 和大松弛速度 (MRS) 響應異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 期間，成年小鼠 CM 細胞位移速度顯示在幅度和矢量場中，具有視覺和數字強度標度檢測或維拉帕米（100 nmol L -1）治療。比例尺，20 微米。(ii) 從以 1 赫茲刺激收縮的 CM 記錄的平均速度圖。(iii) 在異丙腎上腺素或維拉帕米治療對 CM 的影響下獲得了一個單一的收縮-松弛周期。

(B) 用 ISO 和 VERA 進行急性處理會導致 CM 的所有時間參數顯著降低。

(C–E) (C) 用 VERA 處理的細胞表現出 MCS 和 MRS 的減少，而 ISO 誘導這些參數顯著增加。ISO 和 VERA 對縮短面積 (D) 和縮短分數 (E) 產生相反的影響。

(F) (i) 在 MCS 和 MRS 期間，SD 和 mREN 細胞位移速度顯示在幅度和矢量場中，具有視覺和數字強度尺度檢測。比例尺，20 微米。(ii) 在一個收縮-松弛周期中 SD 和 mREN 細胞的圖形比較。(iii)–(iv) SD 和 mREN CM 顯示相似的 MCS 和 MRS。(v)–(vi) 與 SD 相比，mREN 細胞的收縮和松弛時間有所增加。對于每個細胞，我們分析了至少 10 個事件（每個事件對應一個收縮-松弛周期），結果代表這些事件的平均值。結果表示為來自每個實驗組的平均 30 個細胞的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對照相比。

該系統 的另一個特點是可以獲取成人 CM 細胞長度的縮短百分比。在 Motion Visualization 的窗口中（Advanced > Export cell length data— Methods S1：User Manual— section 7.4 Figure 70），用戶可以打開一個新窗口來測量細胞長度的縮短百分比（圖 S3）。該窗口顯示波選擇框，其中包含先前選擇的收縮-松弛波（圖 S3 A上的藍色條，左側）及其各自的圖形（圖 S3 A，右側）。該系統 使用細胞分割過程來獲取細胞邊界長度并應用過濾器來找到細胞的佳分割（圖 S3B). 數據可以可視化并實時繪制圖表（圖 S3 C）。然后，可以導出分析的波形數據。為了驗證我們的分割方法，我們通過使用經異丙腎上腺素和維拉帕米處理或未處理的成人 CM 進行了縮短細胞長度百分比分析。如圖 4 E所示，ISO 增加了成人 CM 細胞長度的縮短百分比，而 VERA 減少了它。綜上所述，我們的數據表明，該系統 可以可靠、高效地處理和分析來自成人 CM 的數據，檢測藥物作用下收縮參數的差異。例如，這種敏感性允許研究可能具有心臟保護作用的藥物，以及與現有心臟病相關的變化。

該系統 在大鼠高血壓模型中的適用性

收縮力缺陷是高血壓動物模型的一個共同特征（Jesus 等人，2020 年；Kovács 等人，2016 年）。在這里，我們使用了一種充分表征的高血壓大鼠模型，該模型由腎外組織中腎素的基因過度表達引起，即 TGR (mREN2)27 大鼠（Langheinrich，1996 年；Mullins 等人，1990 年）。mREN CM 的一個重要特征是細胞面積增加，這是心肌肥大的特征（Jesus 等人，2020 年）). 鑒于 該系統 獲取幅度速度的平均值，比較的單元格之間的大小差異越大，獲取可能存在的差異的靈敏度就越低。因此，與 Sprague-Dawley (SD) 大鼠肌細胞相比，測量肥大 mREN 肌細胞的數據時可能會出現問題。為了避免這個問題，我們通過使用新的過濾器（幅度閾值）實現了一個管道（有關詳細信息，請參見方法 S1：用戶手冊—— 7.3 節，幅度閾值過濾器）。

圖 4 Fi–ii 顯示了帶有運動矢量的 CM 圖像以及 SD 和 mREN 肌細胞的平均速度軌跡的比較。如圖 4 Fiii–iv所示，SD 和 mREN 肌細胞之間的大收縮或舒張速度沒有差異。另一方面，與 SD 細胞相比，該系統 檢測到 mREN 肌細胞的收縮和舒張時間顯著增加（圖 4 Fv-vi）。收縮參數詳見表S2。這些結果通過更詳細地顯示通過矢量場的細胞運動以及整個細胞，擴展了先前的發現（ Jesus 等人，2020 年）。

新生兒 CM 培養和 hiPSC-CM 中的 該系統 驗證

來自不同發育階段的心肌細胞顯示出功能和結構差異。該系統 旨在獲取 CM 在不同成熟和細胞發育階段的多個實驗條件下的收縮參數。hiPSC-CM 和新生兒-CM 是未成熟細胞，與成年心室肌細胞相比表現出明顯的形態和結構組織特征（Bedada 等人，2016 年；Khan 等人，2015 年；Li 等人，2017 年；Rohr 等人， 1991). 這種結構上的不成熟會影響 CM 的收縮性，它比成人 CM 的強度要低得多，并對其采集和分析提出了挑戰。此外，hiPSC-CM 和新生兒 CM 會自組織成合胞體并表現出自發收縮（Bedada 等人，2016 年；Li 等人，2017 年）。

HiPSC-CM 已通過不同的技術進行探索，以獲得收縮和松弛的細胞動力學（Czirok 等人，2017 年；Huebsch 等人，2015 年；Maddah 等人，2015 年；Pointon 等人，2017 年）。然而，它們在研究和臨床中心作為常規應用仍然是一個挑戰，要么是由于實施困難，要么是因為仍然缺少具有強大處理能力的工具以及為非專業觀眾設計的界面。該系統 提供了一種可靠、快速且易于訪問的方法來處理和分析這些細胞類型的收縮動力學，從圖像到終結果集。

使用 該系統，我們確定了 hiPSC-CM（圖 5和S4）和新生兒 CM（圖 6 ）在基礎控制條件下以及與 ISO 和 VERA 孵育后的收縮和松弛周期的平均速度。圖 5 A 顯示了檢測所有 hiPSC-CM 合胞體運動的示例空間圖像，它允許用戶從多個收縮-松弛周期中提取平均速度軌跡（圖 5 B）。為了在單波水平上更好地了解 ISO 和 VERA 治療，圖 5繪制了每個特定波的圖表C. ISO 和 VERA 對 hiPSC-CM 的影響也以濃度依賴的方式發生，并且在速度依賴參數（圖 S4 A）和平均縮短面積（圖 S4 B）上顯示出相反的結果，正如我們對這些藥物的預期. 正如先前在文獻中報道的那樣（Hayakawa 等人，2014 年），在使用 ISO 和 VERA 治療后觀察到收縮和舒張時間的相當減少（圖 S4 C）。此外，ISO 和 VERA 增加了 hiPSC-CM 的跳動頻率（圖 S4 D）。總而言之，這些結果證實了我們系統的多功能性，為用戶提供了獲得視覺和定量評估的可能性通過微妙的修改不同的收縮細胞類型。

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圖 5。異丙腎上腺素和維拉帕米在 hiPSC-CM 收縮力中的收縮波運動和圖形檢測

(A) 從用異丙腎上腺素 (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米 (100 nmol L -1 ) 處理的細胞獲得的視覺和數值強度標度檢測中的 hiPSC-CM 大位移速度。比例尺，50 微米。

(B) 異丙腎上腺素或維拉帕米治療平均速度的圖形檢測。

(C) 比較一個收縮-松弛周期中藥物引起的變化。MCS，大收縮速度；MRS，大弛豫速度。另請參見圖S4。

同樣，圖 6 A 顯示該系統通過膜位移和運動矢量的生成，有效檢測 ISO 和 VERA 新生兒 CM 治療組的細胞收縮力差異（圖 6 Ai-iii ）。此外，分析表明，ISO 和 VERA 均以濃度依賴性方式顯著減少新生兒 CM 的收縮和松弛時間（圖6 B）。正如對這些藥物所預期的那樣，用 ISO 治療會導致速度相關參數（圖 6 C）和 CM 縮短區域（圖 6D)，而 VERA 處理的細胞觀察到減少。此外，該系統檢測了接受藥物治療或未接受藥物治療的新生兒 CM 的自律。在分析新生兒 CM 的搏動頻率時，也觀察到 ISO 和 VERA 的相反結果（圖 6 E）。hiPSC-CM 和新生兒-CM 在用不同濃度的藥物治療后的收縮參數分別列于表 S3和S4中。

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圖 6。異丙腎上腺素和維拉帕米對新生兒 CM 收縮力影響的收縮波運動和圖形檢測

(A) (i) 在從異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 或維拉帕米 (100 nmol/L ?1 ) 治療的作用獲得的收縮-松弛周期期間，新生兒 CM 細胞在視覺和數值強度尺度檢測中的位移速度。比例尺，50 微米。(ii) 從異丙腎上腺素或維拉帕米治療的新生兒 CM 記錄的平均速度修改的圖形檢測。(iii) 比較一個收縮-松弛周期中藥物引起的變化。

(B) 用 ISO 和 VERA 進行急性治療可顯著降低新生兒 CM 的收縮和舒張時間參數。

(C) 用 VERA 處理的細胞表現出 MCS 和 MRS 減少，而 ISO 誘導這些參數顯著增加。

(D) 同樣，ISO 和 VERA 對縮短區域產生相反的影響。

(E) 兩種處理對細胞跳動濃度-反應曲線顯示出相反的效果。從每個細胞區域，我們分析了至少 10 個事件（每個事件對應于收縮-松弛周期），結果代表這些事件在 ISO 和 VERA 存在或不存在的情況下的平均值。結果表示為來自每個實驗組的 20 個細胞區域的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對照相比。

為了總結我們的發現，表 S5比較了收縮和松弛速度的大倍數變化，以及用 ISO 或 VERA 處理的成人 CM、新生兒 CM 和 hiPSC-CM 之間的縮短面積參數。如表S5所示，與成人 CM 和新生兒 CM 相比，hiPSC-CM 在收縮和松弛速度大倍數變化方面對 ISO 的響應較弱。這一發現表明，與 hiPSC-CM 相比，新生細胞的 β-腎上腺素能反應有所改善，并表明這兩種細胞類型之間的成熟度存在差異。盡管成人 CM 和新生兒 CM 具有相似的大倍數變化值，但前者表現出較低的半數大有效濃度，證實了這些細胞對 ISO 的反應更強。這與以下事實一致：與成人 CM 相比，hiPSC-CM 和新生兒 CM 呈現不成熟的 β-腎上腺素能受體信號（Jung 等人，2016 年；Slotkin 等人，1995 年）). 然而，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 對 VERA 的反應更強，在新生兒細胞中觀察到更明顯的抑制收縮作用。同樣，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 顯示 MCS 對 VERA 的半數大抑制濃度降低。這些差異至少部分反映了未成熟細胞對肌膜 Ca 2+循環的高度依賴性和未成熟 Ca 2+釋放單元的存在（ Korhonen 等人，2009 年；Louch 等人，2015 年）。總的來說，這些數據增強了我們軟件檢測細胞對不同藥物的收縮反應差異的敏感性。