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使用多焦點光學相干斷層掃描實現皮膚組織細胞快速成像
光學相干斷層掃描(OCT)是一種強大的工具，提供無創的組織學成像。然而，與其他光學顯微鏡工具一樣，需要高數值孔徑(N.A.)透鏡來產生緊密聚焦，從而產生窄景深，這就需要動態聚焦并限制成像速度。為了克服這一限制，我們開發了一種產生多軸向焦點的超表面平臺，通過提供多個焦平面來提高體積OCT成像速度。該平臺對產生的軸向焦點的數量、位置和強度提供準確和靈活的控制。直徑為8毫米的全玻璃超表面光學元件由熔融硅片制成，并應用于我們的掃描OCT系統中。在所有深度的恒定橫向分辨率為1.1 μm，多焦點OCT將皮膚學成像的體積采集速度提高了三倍，同時仍然清晰地顯示角質層、表皮細胞和真皮-表皮連接的特征，并提供形態學信息作為基底細胞癌的診斷標準。在稀疏的樣品中，成像速度可以進一步提高，例如7倍的7焦光束?？傊@項工作證明了基于超表面的多焦點OCT用于快速虛擬活檢的概念，進一步為開發具有高分辨率和緊湊體積的快速體積成像系統提供了見解。
目前生物學成像中超表面光學的孔徑相對較小(通常直徑為幾百微米)，導致焦距(或工作距離)短，視場(FOV)小，與掃描儀不兼容，并且無法處理大直徑激光束(例如，直徑為毫米)。這項工作旨在解決這些問題。研究者制作了直徑為8mm的全玻璃超表面光學元件，并將這些平面光學元件集成到掃描OCT系統中。我們選擇了全二氧化硅設計來簡化制造過程，并選擇熔融二氧化硅，因為它在紫外到紅外光譜上具有出色的透射性。由于超透鏡具有嚴重的色散，特別是在大直徑和毫米級焦距的情況下，在這項工作中繞過多焦超透鏡，而是使用由超表面多焦產生器和消色差物鏡組成的混合透鏡。實驗證明，混合設計是一種實用可靠的解決方案。
具有多焦點超表面的混合透鏡設計
為了在軸向上產生多個焦點，超表面相位表示為PMeta (x , y) ={[PLens (x , y , f m ) PLens (x , y , f )] × Am (x , y)}。式中(x,y)為平面坐標，M為焦數，f M為目標焦位置，fo為物鏡與多焦超表面配合的焦距，P Lens = 2 n[f 2 (x 2 + y 2) f]/為透鏡相位輪廓，λ為光波長，n為周圍環境的衍射指數，Am (x,y)為二元矩陣，作為分配器將超表面像素隨機分配到不同焦點圖1b中多焦超表面與物鏡的組合給出了M [PLens (x, y, f) × Am (x, y)]的相位調制。在各焦之間均勻分配，且焦強度與焦數的平方成反比。我們制作了四個與圖1b中四個多焦光束對應的多焦超表面，并在OCT系統中進行了測試。在多焦超表面的幫助下，OCT可以產生兩個、三個甚至七個焦平面，圖1c中0.8 μm聚苯乙烯(PS)珠的OCT b掃描(XZ平面)實驗證明了這一點。
光學相干斷層掃描中多焦點光束
由于OCT皮膚成像的樣品通常是致密的，具有很強的光吸收，因此作者有意限制焦點的數量，以實現每個焦點的更高功率。選擇三個多病灶的OCT成像光束:兩個焦點梁1 (2 foci-1)的軸向間隔40μm 超表面像素同樣分配給這兩個焦點(R - 1 = 50%, R2 = 50%),這兩個焦點梁2 (2 foci-2)有一個相同的間隔40μm和不同像素比率(1 = 45%,R 2 = 55%),和三個焦點梁(3Foci)同樣有40μm間隔與比率R 1 = 27%, R 2 = 33%, R 3 = 40%。使用圖S1b所示的工具在OCT光源(910 - 100 nm)下測量三束光束的輪廓。從XZ曲線可以看出，三束多焦光束的焦點位置與設計一致。圖3b顯示了光束在五個深度的橫截面輪廓，表明每個焦點都有一個圓形的高斯輪廓。正態高斯光束和三種多焦光束的軸向強度分布。2Foci-1的兩焦強度比為50:50,2Foci-2的強度比為46:54,3Foci的強度比為25:36:39。實驗值與設計值一致，證明了方法的準確性。圖3d比較了多焦點光束和聚焦高斯光束的光束直徑。所有焦的直徑為1.0 ~ 1.1 μm, DOF為6 μm。在圖3和之后的圖4中，將40物鏡的焦點位置設為Z = 0。2Foci和3Foci光束的焦距分別為4.5 mm 20 μm和4.5 mm + (40 μm, 0 μm, 40 μm)。
高斯光束、雙焦光束(2Foci-1和2Foci-2)和三焦光束(3Foci)對0.8 μm PS微珠的體積成像
在OCT系統中，使用0.8 μm PS微珠對高斯光束和三個多焦光束進行了表征。珠子沿深度方向的最大強度投影表明，高斯光束只能在視場(FOV)中珠子數量相對較少的薄深度層中獲得清晰的珠子輪廓。相比之下，2Foci-1和2Foci-2光束可以清楚地從兩個焦平面上分辨出珠子，在相同的數據采集過程中提供更多有用的信息。同樣，3Foci光束可以顯示最多的珠子，因為它沿著三個焦平面捕獲數據。圖4b給出了五個深度的xyplane。高斯光束在Z = 0處能清晰地分辨出微珠，而在非聚焦深度處，微珠輪廓明顯擴大。兩焦光束在Z = 20和20 μm處具有較好的分辨能力，三焦光束在Z = 40 μm、0和40 μm處具有較好的分辨能力。更多的頭部幻像成像細節見圖S4和圖7。四束光束的軸向強度從頭模體體積測量，并繪制在圖中。如前所述，多焦點光束M表示為M = 1 [F(x, y, F M) Rm]，強度為高吸光樣品中深層區域的增強信噪比。
OCT快速高分辨率細胞成像
目前，細胞分辨率成像是通過高數值鏡頭實現的，并且受限于鏡頭的短DOF。使用40X物鏡對74歲男性鼻側壁正常皮膚進行OCT成像。焦平面位于皮膚表面(Z = 0)，角質層的特征清晰可見，表皮區域的圖像過于模糊而無法區分，如Z = 40和80 μm的XY平面所示。在雙焦光束(2Foci-2)下，b掃描生成兩個焦平面，并精確描繪出Z = 0處角質層和Z = 40 μm處表皮細胞的輪廓。利用三焦光束(3Foci)的OCT系統可以同時在三個焦平面上可靠地獲取細胞分辨率圖像。在Z = 0, Z = 40 μm和Z = 80 μm的離散深度上，細胞很容易被分解。這些實驗結果表明，在相同的參數下，多焦光束可以從多個平面上收集非常詳細的圖像數據，收集的體積是高斯光束的2- 3倍。為了高分辨率的體積成像，動態聚焦被利用。焦平面軸向平移掃描連續逐級深度。每次平移后，對樣品再次進行體積成像，僅提取DOF內的層進行存儲。最后，對所有存儲層進行數字重建，形成完整的高分辨率三維圖像。理論上，軸向運動的數量(z堆)與光束的焦點數量成反比。理論上，與高斯光束相比，雙焦點或三焦點超表面光束只需要一半或三分之一的z堆棧數量，從而允許更快的細胞分辨率皮膚成像。
75歲男性鼻部基底細胞癌(BCC)的OCT影像
圖像通過三焦(3Foci)光束捕獲。與之前所示的正常皮膚樣本相比，BCC樣本顯示角質層較厚，腫瘤角化細胞細胞與周圍基質之間界限不清。角質層呈不規則的蜂窩狀，可見單個明亮的腫瘤島(藍色星號)，周圍是深色的瘤周裂隙(白色箭頭)。圖7d顯示明顯的腫瘤角質形成細胞擁擠在一起，沒有中間的基質細胞(黑色星號)。這些發現與使用高分辨率反射共聚焦顯微鏡(RCM)觀察皮膚癌時所觀察到的BCC特征一致。在RCM中，上述異常形態信息可作為BCC的診斷標準。
在這項工作中，研究團隊展示了基于超表面的多焦點OCT應用于快速組織樣成像(虛擬活檢)的概念。多焦點OCT可以將高質量細胞分辨率皮膚成像的體積采集速度提高三倍，而不會降低空間分辨率?？臻g樣品允許更大的成像速度提高，例如，七焦光束的7倍改進。提出的多焦點相位模型利用隨機空間復用，可以靈活準確地控制焦點的數量、位置和獨立焦點的強度。研究團隊開發了一種大型(例如，直徑8毫米)全玻璃超表面光學元件與熔融硅晶圓的制造工藝。在未來的工作中，我們將開發消色差多焦超透鏡，以實現OCT探頭的小型化，從而顯著增加應用。在這項工作中開發的技術不僅適用于OCT應用，而且也適用于其他微觀系統，如共聚焦、多光子和光聲成像，其中體積成像速度的加速將是有益的。簡而言之，這項工作為開發具有持續高空間分辨率和緊湊體積的快速體積成像系統提供了前景。