過濾器Mahle濾芯PI 2145 PS 3三五及緣分

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資源與能源問題是目前面臨的普遍問題。木質纖維原料因其可再生性和綠色環保的優點越來越引起人們的重視，并由此從石油精煉(Refinery)引出了生物質精煉(Biorefinery)的概念。利用自然界豐富廉價的木質纖維素資源獲取生物燃料和化學品已經成為研究熱點。糖類物質是木質纖維素中碳水化合物的主要組成部分，是植物光合作用中碳同化作用的主要形式，占植物干重的85％～90％[1]，是地球上為豐富、復雜的有機大分子。生物質精煉充分開發糖平臺化合物是可再生資源開發的大方向。然而要開展這些重大科研項目并加深理論機理研究，都要以糖類物質的基礎分析作為切入點。在木質纖維生物質精煉利用的過程中，由于傳統木質纖維利用的造紙工業存在將半纖維素等以黑液的形式燃燒獲取熱能的不合理利用方式[2]，造紙產業升級為綜合林基生物質精煉工廠過程中，糖類物質的新利用方向為半纖維素的有效利用。在木質生物質中半纖維素是僅次于纖維素的主要糖類成分，它是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體，包括木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等。因而半纖維素的有效利用要求進一步確定不同工藝下半纖維素水解糖液中各種糖和糖醛酸，從而在理論上指導科研與產品生產。在生物質精煉過程中篩選并構建一套規范且有效的復雜糖類體系分析方法是該領域科研工作者共同面臨的課題，本文通過借鑒相關領域的新現代儀器分析方法，對這一課題進行了淺析，以期能為讀者提供綜合參考。

1木質生物質及水解液糖類組分

按照聚合度來分，糖類物質可分為：單糖、寡聚糖和多聚糖。按照糖所含的功能基團來分，可分為醛、酮、醇和它們的氧化還原衍生物，以及由糖苷鍵連接此類化合物的聚體。在植物中糖類物質主要是纖維素和半纖維素。纖維素糖類組分較為單一，本論文要點主要針對生物質精煉過程中的組分更為復雜的半纖維素。研究表明，半纖維素是由多種糖單元組成的，常見的有木糖基、葡萄糖基、甘露糖基、半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基等；并且半纖維素分子中還含有糖醛酸基（如半乳糖醛酸基、葡萄糖醛酸基等）和乙酰基；分子中還常有數量不等的支鏈。由此可見，半纖維素是由多種糖基、糖醛酸基所組成的，并且分子中往往帶有支鏈的復合聚糖的總稱[3]。一般針葉木中半纖維素含量為15％～20％，以聚葡萄糖甘露糖為主，同時還有少量聚木糖；而闊葉木中的半纖維素一般占木材的20％～25％，也有的高達35％，主要是聚木糖類，同時還伴隨有少量的聚葡萄糖甘露糖和聚鼠李糖半乳糖醛酸木糖，其中聚木糖類主要是聚O-乙酰基-(4-O-甲基葡萄糖醛酸)木糖。不同原料的半纖維素含量及組成不同。同時不同的生物質精煉過程中分離半纖維素的水解液組分也有很大差異，并且由于水解程度的不同而形成了復雜體系。但就單糖分析而言主要針對葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的定量檢測。

2生物質精煉過程糖類傳統分析方法

復雜體系糖類分析在生物質精煉過程中具有重要意義。在生物質精煉的半纖維素利用過程中，由于半纖維素本身糖基和糖醛酸基種類的多樣化，使得對于半纖維素利用技術的機理研究在很大程度上依賴于多種低聚糖、寡糖及單糖的定性和定量分析。傳統方法由于不能對復雜體系的糖類物質進行分離而難以準確分析。傳統的菲林法、DNS等化學分析方法只是對還原糖等給出定量分析。在制漿造紙檢測分析中，傳統化學分析的聚戊糖含量也是通過鹽酸水解成戊糖并進一步脫水形成糠醛，通過糠醛含量的測定來間接表達半纖維素中的五碳糖高聚物[4]。但這些方法對于生物質精煉半纖維素水解的機理研究和產品開發不能提供更實質性的幫助。早期采用的酶分析法、紙色譜法、薄層色譜法及柱層析法等經典方法可以進行混合糖的分析，但分辨率低、時間長、定量測定困難，使得這些具有初步分離效果的傳統方法也受到了限制。隨著現代儀器分析技術的發展，混合體系的糖類分析也隨之產生了新的分析方法。

3混合糖類組成分析方法

3.1離子色譜法(IC)應用離子色譜法是將改進后的電導檢測器安裝在離子交換樹脂柱后，以連續檢測色譜分離的離子的方法。1975年H．斯莫爾等人將經典的離子交換色譜與高效液相色譜技術相結合，創造了使用連續電導檢測器的現代離子色譜法，現代離子色譜使用小粒度和低交換容量的樹脂及小柱徑的分離柱以及進樣閥進樣，泵輸送洗脫液，具有迅速、連續、高效、靈敏、可同時測定多組分、不需要預先衍生化等優點，可用于分析幾乎所有的單糖、大部分的寡糖及低聚糖。彭云云等[5]采用離子色譜法分析甘蔗渣半纖維素中各種糖基及糖醛酸，水解液經中和、過濾、稀釋即可測定，采用色譜條件：色譜柱：淋洗液：0.001molNaOH-0.05molNaAC；CarboPaePAl(2×250mm)，保護柱：CarboPacPAl(2×50mm)；柱溫：30℃；體積流量：0.650ml/min；進樣體積：10μL；檢測器：脈沖安培檢測器，金電極。結果表明氫氧化鈉和醋酸鈉淋洗液梯度洗脫可以分析糖醛酸及單糖組成，靈敏度高、重現性好、結果準確。

3.2高效液相色譜法(HPLC)應用高效液相色譜(HPLC)采用高壓液相泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，具有分辨率高、分離速度快、分離效果好、不破壞樣品、重現性好的優點。單糖檢測器有紅外檢測器、示差折光檢測器、光散射檢測器、電化學檢測器和紫外檢測器。由于糖類本身沒有紫外吸收，若不進行衍生化只能采用蒸發光散射檢測器(ELSD)或示差折光檢測器(RI)。將糖類物通過衍生化轉變為具有紫外吸收或可產生熒光的物質可實現高靈敏度檢測和痕量分析，但操作復雜。方宏等[6]用高效液相色譜法測定甘蔗渣半纖維素水解物中的單糖含量。以HypersilNH2柱為色譜分析柱，用示差折光檢測器檢測，流動相是乙腈∶水(8∶20)。在此色譜條件下，甘蔗渣半纖維素水解物分離成：木糖、阿拉伯糖、果糖和葡萄糖。各單糖呈良好的線性關系。加樣回收率的平均值為97.3%～98.7%，此方法簡便、快速、準確，適合檢測下限要求不高的生物質半纖維素水解糖液。AloiaRomaní等[7]對桉木生物質精煉過程中自催化半纖維素糖液中葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、糠醛、羧甲基糠醛等進行了高效液相色譜一次性分析，而低聚糖則采用4%硫酸水解后二次測定單糖增加量的方法，作為實驗過程中的常規檢測操作快捷、重現性好。利用HPLC測糖，要根據樣品中的糖的種類、含量和純度來選擇合適的檢測器，同時根據實驗的具體需要決定是否需要較為復雜的衍生化過程及昂貴的糖柱。

3.3高效陰離子交換-脈沖安培檢測法（HPAE-PAD）應用高效陰離子交換-脈沖安培檢測法（HPAE-PAD）是一種陰離子交換色譜與脈沖安培檢測器結合的新的液相色譜法，檢測*可達到幾十個ug/L水平。糖類化合物是一種多羥基醛或酮，可分為單糖、低聚糖和多糖，低聚糖由2～10個單糖分子失水而成，多糖是由10個以上單糖分子失水而得，低聚糖和多糖水解后即得單糖。中性糖類為Pka在12～14之間的弱酸。在高pH值的淋洗液中，例如10～20mmol/LNaOH中，它們會部分或全部以陰離子形式存在，能在陰離子交換柱上保留并得到分離。梁立娜等[8]利用高效陰離子交換-脈沖安培檢測（HPAE-PAD）同時分離測定8種單糖和2種糖醛酸。以CarboPacPA20陰離子交換柱為分離柱，以2mmol/LNaOH溶液將8種單糖從分離柱上洗脫，而后用NaAc（50～200mmol/L）梯度淋洗2種糖醛酸，淋洗液流速0.5ml/min，分析時間30min。8種單糖和2種糖醛酸的檢出限為2.5～14.4μg/L。5mg/L的10種化合物的混合標準溶液連續7次進樣，峰面積的相對標準偏差為0.3%～1.5%。用所建立的方法測定了多糖水解液和木材半纖維素水解液中的單糖和糖醛酸含量。劉婷[9]利用高效陰離子交換分離-脈沖安培檢測分析不同茶葉多糖中的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖。陰離子交換柱：METROSEPCARB(150×4.0mm)；淋洗液：6.0mmol/LNaOH溶液；柱溫：32℃；淋洗液流速：1.0ml/min；分析時間：45min；進樣體積：20μl。優化條件下4種單糖的檢出限為0.125～2.0mg/L。樣品測定的回收率為91.8％～99.3％。所建立的方法分析4種常見茶葉多糖快速、有效。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)的一大優點是不需要衍生化就能分析單糖、大部分的寡糖及低聚糖，節約時間和資金，避免了有毒衍生試劑的使用，對于組成結構大小上非常相近的單糖也有很好的分離效果。

3.4氣相色譜法(GC)應用氣相色譜是多糖結構分析中重要的手段之一，它與質譜聯用可以得出有關單糖殘基類型、鍵的連接方式、糖的序列和糖環形式、聚合度等多種結構信息。此外，由于大量的固定液和不同的檢測器適用于糖的氣相色譜分析，因而用氣相色譜法測定糖類具有樣品用量少、選擇性好、分辨率強、靈敏度高以及可用于定性及定量分析等優點。康學軍等[10]以三水解白芷多糖，水解產物中加入鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐，衍生化反應生成糖腈乙酸酯衍生物，采用氣相色譜法測定白芷多糖的單糖組成。用OV-101毛細管色譜柱；進樣溫度為210℃；檢測器溫度為240℃；柱溫為程序升溫：初始柱溫110℃，維持5min，以5℃/min的升溫速率升高到190℃，維持4min，以3℃/min的升溫速率升高到210℃，維持20min。白芷多糖中含有木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖等7種單糖成分，并測定計算出已知6種單糖：鼠李糖-阿拉伯糖-木糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖的摩爾構成比1.19∶1.19∶0.765∶1∶8.08∶3.34。氣相色譜法（GC）分析糖類，主要困難在于糖類沒有足夠的揮發性，須在色譜分析之前預先轉化成對熱較穩定的、易揮發的衍生物。但在衍生物的制備過程中，由于糖的異構化會產生衍生物的異構體，使色譜分析時每種糖產生幾個峰，從而影響了組分的分離和定量。

3.5薄層色譜法(TLC)應用薄層色譜法(TLC)是一種微量、快速、簡便、有效的定性的半定量和定量分析方法。薄層色譜的特點是可以同時分離多個樣品，分析成本低，對樣品預處理要求低，對固定相、展開劑的選擇自由度大，適用于含有不易從分離介質脫附或含有懸浮微粒或需要色譜后衍生化處理的樣品分析。而新的高效薄層色譜(HPTLC)采用更細、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對吸附劑進行疏水和親水改性,可以實現正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性。焦廣玲等[11]建立了不同展開體系中薄層色譜分析單糖或寡糖的有效方法。以淀粉寡糖、右旋糖酐寡糖以及古羅糖醛酸寡糖3個系列寡糖和半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、巖藻糖、木糖和鼠李糖9種單糖為研究對象，探討其在不同展開體系下的薄層色譜行為。在各種糖TLC分析中，若供試品中主要含有酸性寡糖，則選擇甲酸展開體系；若供試品含有不同連接方式的中性寡糖，則選擇氨水展開體系進行二次展開；若只對單糖進行分離鑒別，應采用三乙胺展開體系，并采用苯胺一二苯胺顯色劑，根據Rf值和顯色的不同，區別單糖的類型。于立芹[12]等測定紅薯葉中多糖，經Sephadex-G100凝膠層析法純化后，利用薄層色譜法結合酸水解，糖腈乙酰化氣相色譜分析法測定紅薯葉多糖的單糖組成和各組成的物質的量比。紅薯葉多糖的單糖組分有木糖、甘露糖、葡萄糖，其量的比為0.47∶0.35∶0.18。糖腈乙酸酯衍生化方法能較好地實施紅薯葉多糖水解產物的衍生化。衍生產物經干燥沒有發現色譜峰明顯拖尾現象，適于單糖衍生化產物GC分析前的處理。

3.6高效毛細管電泳法(HPCE)應用高效毛細管電泳法(HPCE)是近年來發展快的分析方法之一。是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異實現分離測定的液相分離方法[13]。毛細管電泳技術分離糖必須解決電荷問題，除氨基糖、糖醛酸及一些硫酸化糖外，天然糖分子都呈電中性，不能在電場中遷移。因此糖的毛細管分離分析中要采用解離、絡合、衍生技術使糖帶電。汲晨鋒等[14]采用水提醇沉法從新鮮蘆筍中提取粗多糖，采用高效毛細管電泳法測定單糖組成，可以實現蘆筍粗多糖中的木糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的分離測定，得到其百分比分別為3.44％、7.92％、10.52％、17.15％、41.85％。研究發現其緩沖鹽濃度和pH值對單糖組分的分離度影響較大，文章通過比較發現緩沖鹽濃度為75mmol/L、pH10.5時，分離度好。通過蘆筍多糖和混合單糖的的毛細管電泳圖譜比較，可鑒別出大部分單糖。該技術分離效果清晰、定量準確、時間短、進樣量少，獲得了較好的結果。汪紅等[15]采用苯酚-硫酸比色法測定了丹參藥材中總多糖的含量，檢測波長為490nm，丹參總多糖在0.1122～0.561mg范圍內其濃度與吸光度線性關系良好(r=0.9998)；以毛細管電泳法測定丹參粗多糖組成，檢測波長206nm，結果顯示，丹參粗多糖由鼠李糖∶木糖∶核糖∶葡萄糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶半乳糖以2.8∶1.0∶8.5∶12.7∶4.2∶15.3∶58.8的摩爾比組成。

3.7質譜及質譜聯用技術由于組成單糖種類與數目等的不同，糖的結構十分復雜，要*闡明一個糖的結構，需要提供以下幾方面的信息：（1）分子量及組成單糖的種類與摩爾比；（2）各糖環的構象（呋喃型或吡喃型）與異頭碳的構型；（3）各糖殘基間的連接方式；（4）糖殘基的連接順序；（5）二級結構及空間構象等。質譜，尤其是GC-MS（EI或CI方式）用于單糖分析已有幾十年的歷史，現已廣泛用于糖組成分析及甲基化分析以確定糖殘基的連接方式。徐正華等[16]建立了氣相色譜-質譜(GDMS)法同時測定乳酸和葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖、半乳糖、乳糖、1,5-脫水山梨醇、山梨醇7種糖的方法。選擇核糖醇為內標，進樣前行肟化反應再進行硅烷化反應。采用DB-5熔融石英毛細管柱，升溫程序為初始溫度70℃，保持4min，以8℃/min的速率升300℃，保持3min。在優化測定條件下各對照品得到良好分離，且在測定范圍內具有良好線性關系(r2>0.983)，平均加標回收率為74.5％～104.2％，該方法簡便、靈敏度高。孫多志等[17]在秸稈兩步稀酸水解工藝中，用氣相色譜／質譜(GC/MS)法對其水解液中的單糖成分進行測定，采用2％的氨溶液將稀酸水解液中的單糖還原成糖醇，然后在甲基咪唑催化劑的作用下和乙酸酐在水相中直接反應生成乙酰化的糖醇，用二氯甲烷萃取后進行GC/MS測定。研究結果表明：秸稈稀酸水解液中有五種單糖，主要是木糖和葡萄糖，其次是阿拉伯糖、半乳糖和少量的甘露糖；利用此方法測定了一批秸稈稀酸水解液，得到了該秸稈稀酸水解過程的佳的反應時間。該方法可快速、準確測定秸稈稀酸水解液中單糖的濃度，為水解工藝的研究提供了一種有效的分析方法。

4多糖結構分析

在生物質精煉過程中伴隨著多聚糖的化學變化，研究多糖結構變化對于糖平臺化合物的理論研究和產品開發具有重要意義。據文獻調研表明，目前該方法研究還處在起步階段，需要借鑒其他領域的現代分析方法，并且應用到相關的基礎研究工作中去，從而積累更多分析經驗和方法創新。近年來多糖的結構分析的儀器設備、分析方法都有了很大的提高。目前已有應用的方法包括紫外光譜法、紅外光譜法和核磁共振分析法等。例如應用1HNMR可以鑒別多糖中糖苷鍵位置，并進一步確認多糖結構。AshutoshMittal等[18]通過核磁共振氫譜的測定方法分析在不同溫度和時間下闊葉木自催化水解半纖維素溶出物，從而評估該過程的反應機理。對殘留的聚木糖、低聚木糖、木糖、葡萄糖及糖類次級衍生產品，例如糠醛、羧甲基糠醛，進行了測定分析。單糖和低聚物則采用新的高分辨率核磁共振氫譜光譜分析法。該方法能定量分析水解抽提后的木料上殘余的聚木糖和纖維素殘留以及水解產物中的木糖和葡萄糖。研究表明，該方法具有良好的再現性并為分析碳水化合物的組成結構提供了與以往報道方法結果可比擬的新方法。Xue-MingZhang等[19]采用傅里葉紅外變換、1H,13C以及2D-HSQCNMR核磁共振的分析方法，對有機溶劑提取的某白楊木品種半纖維素糖液進行全面定性和定量分析，研究了木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及各種糖醛酸的組成，并通過核磁共振的方法研究了特定品種半纖維素的結構特點，包括乙酰化半纖維素與葡萄糖醛酸、葡萄糖甘露聚糖的鍵合方式等，為進一步發酵特定產品的機理研究提供了重要參考。

5技術對比與展望

與傳統糖類分析方法相比較，氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)、高效陰離子交換-脈沖安培檢測法（HPAE-PAD）、離子色譜法(IC)、高效薄層色譜(HPTLC)等高效分離分析技術在很大程度上促進了糖類平臺化合物的理論研究。各種方法在糖類物質分析方面都有應用，但也存在著各自的利弊特點。在未形成規范檢測體系前，復雜體系的糖類分離檢測要根據糖類物質的具體性質而定，并在實際檢測分析的工作中進行篩選和總結。采用氣相色譜測定糖類，問題在于分析前預先轉化成易揮發、對熱較穩定的衍生物。在某些衍生物的制備過程中，由于糖的異構化會產生衍生物的異構體，進而影響組分的分離和定量。高效液相色譜分離速度快、分離效果好、分辨率高、重現性好且不破壞樣品，但糖類本身沒有紫外吸收，只能采用示差折光檢測器(RI)或蒸發光散射檢測器(ELSD)檢測。RI分辨率低而ELSD雖然效果好但價格昂貴，一般采用氨基柱但分離效果欠佳，而的糖柱又十分昂貴。薄層色譜法(TLC)是一種常規實驗室可快速分析單糖組成的微量而快速的分析方法，但對于復雜體系糖液分析的準確度相對較低、適應性不強。離子色譜法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高、可同時測定多組分，且不需要預先衍生化就能分析單糖、大部分的寡糖及低聚糖，正在為越來越多的研究者所采用。總體分析，高效液相色譜可以通過改變分離模式和色譜柱滿足不同性質糖的分離，且有多種檢測方法能夠與其聯用以滿足定性和定量分析的要求。隨著新型、高選擇性的固定相，高靈敏度衍生化試劑以及質譜等高效檢測技術的研究與發展，高效液相色譜及相關技術在生物質精煉過程復雜體系的糖液分析中的地位必將愈加重要。離子色譜中陰離子交換色譜法-脈沖安培檢測技術對糖類化合物的分析檢測正逐步成熟完善。目前分析工作者正努力把陰離子交換色譜法-脈沖安培檢測的金電極的高靈敏性的檢測優點與帶有鋇離子的稀堿淋洗液的高效分離法的優點結合起來，形成一種測定植物提取液中溶解糖類的理想方法