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所有數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差除非另有說明，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。顯示了代表性數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過使用 Graphpad Prism 6軟件的方差分析和 Bonferroni 事后檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較和兩組學(xué)生的 t 檢驗(yàn)來確定。P 值 < 0.05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果 AT101誘導(dǎo) MPNST 細(xì)胞中半胱天冬酶非依賴性細(xì)胞死亡，使用 NF-1患者來源的 MPNST 細(xì)胞系(T265-2c，ST88-14和90-8細(xì)胞)評(píng)估 AT101對(duì)人 MPNST 細(xì)胞的作用。為了確定 AT101是否抑制 MPNST 活力，用5-20μMAT101處理細(xì)胞24-72小時(shí)，并使用鈣黃綠素 -AM 切割測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn) AT101以濃度和時(shí)間依賴的方式降低 MPNST 細(xì)胞活力(圖1A-B)。我們證實(shí)該載體(DMSO)在使用濃度(1-4μl/ml 培養(yǎng)基)時(shí)對(duì)細(xì)胞活力沒有影響(圖1)。S1A，B).由于(-)-棉酚已被報(bào)道在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)生長抑制[28] ，并且鈣黃綠素 -AM 切割測(cè)定僅測(cè)量活細(xì)胞，我們通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量處理的細(xì)胞中的乙錠同型二聚體 -1染色來評(píng)估 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。AT101處理導(dǎo)致乙錠同型二聚體 -1陽性死亡 ST88-14細(xì)胞百分比的濃度依賴性增加(圖1C; 在另外兩種細(xì)胞系中獲得類似的結(jié)果; 數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1。AT101引起 MPNST 細(xì)胞中半胱天冬酶非依賴性的非凋亡性細(xì)胞死亡。 AT101處理的細(xì)胞表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性的活力降低(A，B)。AT101處理在 ST88-14細(xì)胞中引起濃度依賴性細(xì)胞毒性(C)。細(xì)胞活力的喪失不伴隨著半胱天冬酶 -3樣酶活性的增加(D) ，BAF 廣泛的半胱天冬酶抑制不能保護(hù) AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(E)。AT101(15μM，24小時(shí))處理不增加 T265-2c 細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白 V 染色(F)。以星形孢素(STS)為陽性對(duì)照，誘導(dǎo)半胱天冬酶 -3樣活性、膜聯(lián)蛋白 V 染色和半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡。* p-value < 0.05.# = 不顯著，p 值 > 0.05。

由(-)-棉酚誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡可以由半胱天冬酶依賴性或半胱天冬酶非依賴性機(jī)制引起[24] ，[29]。為了確定 AT101是否觸發(fā) MPNST 細(xì)胞中的效應(yīng)半胱天冬酶活化，在裂解后在 AT101處理的細(xì)胞中測(cè)量活性效應(yīng)半胱天冬酶(半胱天冬酶 -3,6和7)的藥理學(xué)底物 devD-AMC 的切割。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理對(duì) T265-2c 和 ST88-14細(xì)胞中半胱天冬酶 -3樣的酶活性沒有影響(圖1D)。與這些結(jié)果一致，用廣譜半胱天冬酶抑制劑 BAF 預(yù)處理不減弱 T265-2c 和 ST88-14細(xì)胞中 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，與其抑制星形孢菌素誘導(dǎo)的這些細(xì)胞死亡的能力相反(圖1E)。為了進(jìn)一步確定 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞死亡是否為凋亡，我們通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了處理的 T265-2c 細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶染色。AT101處理不增加膜聯(lián)蛋白 V 陽性細(xì)胞而增加碘化丙啶陽性細(xì)胞(圖1F)。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們得出結(jié)論，AT101通過半胱天冬酶依賴性凋亡以外的機(jī)制導(dǎo)致 MPNST 細(xì)胞死亡。在 MPNST 細(xì)胞死亡過程中 AT101觸發(fā)的自噬不具有細(xì)胞保護(hù)作用

-)-棉酚先前已經(jīng)顯示在其他癌癥類型中刺激自噬[30] ，[31]。然而，細(xì)胞保護(hù)作用和細(xì)胞毒作用都?xì)w因于(-)-棉酚誘導(dǎo)的癌細(xì)胞自噬[24] ，[31]。因此，我們首先詢問 AT101是否也刺激 MPNST 細(xì)胞的自噬。對(duì) AT101處理的細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡并探測(cè) LC3 II 水平的變化，LC3 II 是一種被廣泛接受的自噬空泡(AVs)的替代標(biāo)志物[32]。與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，AT101處理的細(xì)胞 LC3 II 的穩(wěn)態(tài)水平顯著增加(圖2A)。我們通過進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)來證實(shí)這一觀察結(jié)果，這表明 AT101處理改變了 LC3樣免疫反應(yīng)性的細(xì)胞內(nèi)分布，從相對(duì)較弱的彌散染色模式到與 T265-2c 細(xì)胞中增強(qiáng)的 AV 含量一致的強(qiáng)點(diǎn)狀模式(圖2B)。

圖2。AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞自噬不具有細(xì)胞保護(hù)作用。用 AT101處理導(dǎo)致 MPNST 細(xì)胞中 LC3-II 穩(wěn)態(tài)水平的濃度依賴性增加(A)和指示 AV 積累的點(diǎn)狀 LC3樣免疫染色模式(B)。AT101引起 MPNST 細(xì)胞中自噬通量的增加，如用 AT101(10μM，24小時(shí))和 BafA1(100nM，收集裂解物前4小時(shí)加入)處理的細(xì)胞中 LC3 II 水平的增加所證明的與單獨(dú)的藥物(C)相比。用3-甲基腺嘌呤(用 AT101處理前1小時(shí)3MA-5mM)處理的 T265-2c 細(xì)胞顯示 LC3-II 積累水平降低(D)和 AT101(15μM，24小時(shí))誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(E)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.

雖然 LC3 II 水平的增加表明 AV 的積累，這可以反映增加的自噬誘導(dǎo)和/或減少 AV 降解。因此，我們?cè)u(píng)估了在存在或不存在 Bafilomycin A1(BafA1)(一種阻斷 AV 降解的液泡 ATP 酶抑制劑)的情況下用 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中的自噬通量[33]。我們觀察到，與單獨(dú)使用兩種藥物相比，用 AT101和 BafA1處理的細(xì)胞中 LC3 II 水平增加，表明 AT101刺激房室形成(圖2C)。為了評(píng)估 AT101誘導(dǎo)的自噬在 MPNST 細(xì)胞中的功能作用，我們通過在暴露于 AT101之前用3-甲基腺嘌呤(3MA)(圖2D)處理細(xì)胞來抑制 AV 形成。3MA 是一種 III 類磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑，這是啟動(dòng)自噬所必需的[34] ，[35]。我們發(fā)現(xiàn)3MA 對(duì)自噬的藥理學(xué)抑制導(dǎo)致了 AT101誘導(dǎo)的 T265-2c 細(xì)胞死亡的適度但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的減弱(圖2E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞自噬不具有細(xì)胞保護(hù)作用，并且可能發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。 BNIP3介導(dǎo) MPNST 細(xì)胞中 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 BNIP3是參與細(xì)胞死亡，自噬和線粒體清除的非典型 BH3-only 蛋白[36]。BNIP3可以介導(dǎo)非凋亡形式的細(xì)胞死亡，這是半胱天冬酶獨(dú)立的，并與誘導(dǎo)自噬有關(guān)，響應(yīng)于一些刺激[37]-[39]。這些觀察結(jié)果使我們假設(shè) BNIP3介導(dǎo) AT101刺激的 MPNST 細(xì)胞死亡。

我們首先詢問在用5-20μMAT101處理24小時(shí)的 MPNST 細(xì)胞中 BNIP3蛋白水平是否增加。全細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析表明，AT101處理以濃度依賴性方式增加 BNIP3蛋白的水平(圖3A)。免疫細(xì)胞化學(xué)同樣顯示在 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中 BNIP3樣免疫反應(yīng)性增加(圖3B)。為了確定 BNIP3蛋白的增加是否與 mRNA 的相應(yīng)增加相關(guān)，我們使用定量實(shí)時(shí) PCR 來評(píng)估用 AT101處理后 MPNST 細(xì)胞中 BNIP3 mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與未處理的 MPNST 細(xì)胞相比，AT101處理導(dǎo)致 BNIP3 mRNA 水平顯著增加(圖3C)。

圖3。BNIP3調(diào)節(jié) MPNST 細(xì)胞中 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞在蛋白質(zhì)印跡(A)和免疫細(xì)胞化學(xué)(B)上顯示 BNIP3蛋白的濃度依賴性增加。與未處理的細(xì)胞相比，AT101處理導(dǎo)致 MPNST 細(xì)胞中 BNIP3 mRNA 的顯著增加(C)。AT101(10μM，24小時(shí))不顯著改變 T265-2c 細(xì)胞中 BCL-2，BCL-xL，BIM，PUMA 和 BECLIN1蛋白水平的表達(dá)(D)。用針對(duì) BNIP3的 siRNA 轉(zhuǎn)染的 T265-2c 細(xì)胞在用 AT101(E)處理后顯示 BNIP3蛋白水平(相對(duì)于 GAPDH 的比率)顯著降低，并且相對(duì)于用非靶 siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯著保護(hù)免于 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(F)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.

由于(-)-棉酚已被報(bào)道影響一些 BCL-2家族成員的蛋白質(zhì)水平，我們檢測(cè)了 AT101處理后 T265-2c 細(xì)胞中 BCL-2，BCL-xL，BIM，PUMA 和 BECLIN1的水平。我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的水平在很大程度上不受 AT101處理的影響(圖3D)。