一、暗視野觀察
暗視野實際是暗場照明發.它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現明亮的象.
暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見.
暗視野觀察所需要的附件是暗視野聚光鏡.它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,高達0.02—0.004
二、相差鏡檢法
在光學顯微鏡的發展過程中,相差鏡檢術的發明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就.我們知道,人眼只能區分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本.
相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現象,將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見.這大大便利了活體細胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡.
相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見.光線透過標本后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變為1/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差.在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:
1.環形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上.
2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.分為兩種:
(1).A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差).
(2).B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗
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