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賽爾瑞成（北京）生命科學技術有限公司
中級會員·7年您現在的位置： 賽爾瑞成（北京）生命科學技術有限公司>>分子生物學試劑>> CR3002快速T4 DNA連接酶 T4 DNA Ligase (Rapid)
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產品簡介
| 純度 | 95% | 供貨周期 | 現貨 |
|---|---|---|---|
| 規格 | 200000U | 貨號 | CR3002 |
| 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
產品概述
T4 DNA Ligase催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5'-磷酸末端和3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻。
產品組分
T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl)
來源
克隆有來自T4噬菌體DNA Ligase基因的重組E. coli菌株。
保存條件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃運輸。
單位定義
1單位指在50 μl 1 × T4 DNA連接酶反應緩沖液中，23℃反應條件下，30分鐘能使50% 的經HindⅢ消化的λDNA片段(100 ng)連接所需的酶量。
反應緩沖液
2× Rapid Ligation Buffer
132 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C
20 mM MgCl2
2 mM DTT
2 mM ATP
15% PEG 6,000
10 × T4 DNA Ligase Buffer
500 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C
100 mM MgCl2
50 mM DTT
10 mM ATP
注意事項
1. 建議插入片段與載體的摩爾比應在3:1 - 10:1。
2. 平末端載體與片段進行連接時，應首先將載體進行去磷酸化處理，防止其自身環化。
3. dA-Tailing產物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。
4. T4 DNA Ligase不穩定，使用時冰上操作，用完立即放回-20℃。
實驗案例1: DNA片段和載體DNA的連接
1. 在微量離心管中配制如下連接反應體系:
ddH2O | to 10 μl |
10 × T4 DNA Ligase Buffer | 1 μl |
插入片段a | 0.3 pmol |
載體DNAb | 0.03 pmol |
T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl) | 0.5 μl |
a. 插入片段與載體的摩爾比應在3:1 - 10:1。
b. 平末端載體與片段進行連接時，應首先將載體進行去磷酸化處理，防止其自身環化。
2. 16°C過夜反應
3. 轉化
4. 將連接產物加入到100 μl感受態細胞中(連接產物的體積不應超過感受態細胞體積的1/6)，輕輕彈勻，冰上孵育30 min。
5. 將離心管置于42°C水浴，不要晃動，準確熱激90 sec后，立刻置于冰水浴中，靜置2 - 3 min。
6. 向離心管中加入900 μl LB或SOC培養基，150 rpm，37°C振蕩培養45 min，使菌體復蘇，抗性基因表達。
7. 5,000 rpm(2,500 × g)離心5 min，去掉900 μl上清。用剩余培養基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。室溫正置10 min。
8. 待菌液被平板吸收后，37°C倒置培養過夜。
▲如果使用超級感受態細胞(轉化效率>108 cfu/μg)，可直接吸取100 - 200 μl孵育后的菌液涂板。剩余菌液可在4°C保存，一周之內都可重新涂板。
實驗案例2: DNA文庫構建中接頭連接反應
1. 在微量離心管中配制如下連接反應體系:
dA-Tailing產物a | 10 μl |
2 × Rapid Ligation Buffer | 15 μl |
DNA Adapter b | 2.5 μl |
T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl) | 1 μl |
ddH2O | 1.5μl |
用移液器輕輕吹打混勻
a. 產物為5'端磷酸化，3'端帶dA的DNA片段。
b. dA-Tailing產物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。
2. 在PCR儀中進行連接反應:
30°C | 10 min |
4°C | Hold |
反應結束后，立即進行后續反應。
產品目錄
貨號 | 產品名稱 | 規格 | 目錄價格 |
CR3001 | T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl) | 40000U | 125 |
CR3002 | T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl) | 200000U | 460 |
注：小包裝需加收干冰費用
