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2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

WB,IP等

動物細胞/組織

1、 使用方便。
2、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
3、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
4、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性。

WB,IP等

1.離心機
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 使用標準Dounce勻漿器勻漿，如果沒有標準Dounce勻漿器，用普通玻璃勻漿器勻漿也可，但是線粒體膜蛋白回收率可能會下降。
? 用新鮮的細胞/組織樣本，也可以用凍存的細胞/組織樣本，但是線粒體膜蛋白回收率會下降。
? 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
? 提取液C在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
? 膜蛋白電泳時loading buffer應該避免煮沸。
? 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。

?

細胞樣本：
1. 提取液準備：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
每200 μl冷的試劑D中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取2×107個細胞，在4℃，500×g條件下離心5分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。貼壁細胞消化或直接刮下進行相應洗滌即可。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 加入400 μl冷的試劑 A，置4℃條件下持續輕微振蕩5-15分鐘。用Dounce勻漿器充分勻漿20-30次。
5. 然后在4℃，500×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
6. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
7. 在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，留沉淀。
8. 在沉淀中加入200 μl冷的試劑B，混勻。
9. 在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入200 μl冷的試劑C，高速渦旋振蕩15秒，置4℃條件下持續輕微振蕩15-30分鐘。
11. 在37℃水浴/氣浴10分鐘。
12. 在37℃條件下1000-2000×g離心5分鐘，此時溶液分為兩層（對著光線看），下層約為20-40 μl。
13. 小心吸取上層丟棄，留下下層溶液。
14. 用50-100 μl冰冷的膜蛋白溶解液溶解下層，即得線粒體膜蛋白。
15. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

組織樣本：
1. 提取液準備：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
每200 μl冷的試劑D中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取100 mg左右的組織樣本，用刀將組織盡可能剪碎，用PBS緩沖液或生理鹽水洗滌干凈。
3. 加入適量PBS（或400 μl冷的試劑A），用Dounce勻漿器充分勻漿20-30次。
4. 然后將勻漿液在4℃，500×g條件下離心5分鐘。
5. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
6. 將上清在4℃，1000×g條件下離心10分鐘，棄沉淀，收集上清。
7. 在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，收集沉淀。
8. 在沉淀中加入200 μl冷的試劑B，充分混勻。
9. 在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中加入200 μl冷的試劑C，高速渦旋混勻5秒，置4℃條件下持續輕微振蕩20-30分鐘。
11. 在37℃水浴/氣浴10分鐘。
12. 在37℃下1000×g離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層約為20-40 μl。
13. 小心吸取移除上層，留下下層。
14. 用50-100 μl冰冷的膜蛋白溶解液溶解下層，即得線粒體膜蛋白。
15. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

1.蛋白濃度低？
處理部分組織樣本時可能沒有裂解，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A和試劑C的處理時間即可。在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
線粒體膜蛋白豐度較低，在條件允許的情況下，需要盡可能的加大細胞樣本的上樣量，才能收獲足夠的膜蛋白。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑D中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

4.膜蛋白電泳沒有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時采用低電壓低電流電泳。
膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。

1.Tianhui Pan, et al.
ANKRD22, a novel tumor microenvironment-induced mitochondrial protein promotes metabolic reprogramming of colorectal cancer cells
Theranostics 2020 （IF=8.579）