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2-8℃ 避光

開蓋后組份按要求條件保存。

6個月

分光光度計

血清血漿/組織/細(xì)胞

1.本試劑盒中試劑均無刺激性氣味，對操作人員無任何毒害。
2.快速準(zhǔn)確，操作簡便，每小時可測100例以上樣本。
3.靈敏度高，血清或血漿樣品只需0.1 ml，或者更少。
4.再現(xiàn)性好，變異系數(shù)CV=1.5%，同一份標(biāo)本數(shù)次測試結(jié)果相關(guān)極微。
5.呈色穩(wěn)定，呈色后一天內(nèi)測吸光度不變。
6.血清樣品放置40℃，3~5天內(nèi)測試結(jié)果不變。—70℃以下可保存?zhèn)€月至半年。
7.測試面廣，可測血清、血漿、各種組織勻漿，培養(yǎng)細(xì)胞等。
8.不需昂貴與特殊儀器，只需恒溫水浴箱或鋁鍋、鋁盆開蓋煮沸，及721、722、751、752分光光度計任一型號均可。
9.穩(wěn)定，不受氣溫等外界因素的影響。

分光光度計

1.分光光度計（對應(yīng)波長的酶標(biāo)儀或半自動生化儀）
2.37℃恒溫水浴鍋
3.離心機(jī)
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰盒

1.生理鹽水
2.雙蒸水
3.PBS
4.蛋白定量試劑盒

1.試管
2.吸頭
3.離心管
4.96孔板

1.必須使用干凈的試管。
2.配制試劑時要充分混勻，加樣或加試劑時要垂直加入試劑中，避免加到管壁。
3.水浴時間和溫度必須固定。
4.血漿、血清或尿液樣品制備后可以直接用于MDA測定。
5.組織或細(xì)胞可以使用PBS或裂解液進(jìn)行勻漿或裂解。對于組織，組織重量占勻漿液或裂解液的比例為10%；對于細(xì)胞，每100萬細(xì)胞使用0.1ml裂解液或勻漿液。勻漿或裂解后，1600g離心10分鐘取上清用于后續(xù)測定。勻漿或裂解等樣品制備步驟宜在冰浴或4℃進(jìn)行操作。
6.對于組織或細(xì)胞樣品，樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。
7.95℃水浴用帶蓋試管，如無帶蓋試管，可用保鮮膜扎口，水浴時用針扎一小孔。
8.試劑A溫度低時會凝固，使用前水浴加熱溶解至透明。
9.測定樣品吸光度值較低時，可將水浴延長至80min，但應(yīng)同時延長，以免造成批間差異。
10.避免使用EDTA、枸櫞酸、氟化鈉、草酸等抗凝劑。
11.待測樣本如不能及時測定，應(yīng)置于-20℃保存，4天內(nèi)穩(wěn)定。

樣品測定：
1. 樣品處理
①血清、血漿、尿液、腦脊液樣本：從待測樣本中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，直接檢測，如超過線性范圍，用生理鹽水稀釋后檢測。
②組織、細(xì)胞等樣本：組織或細(xì)胞可以使用PBS或貝博的Western及IP細(xì)胞裂解液等進(jìn)行勻漿或裂解。
勻漿或裂解組織時，組織重量占勻漿液或裂解液的比例應(yīng)為10%；
對于細(xì)胞，每106 個細(xì)胞使用0.1ml裂解液或勻漿液。勻漿或裂解后，1600g離心10min，取上清用于后續(xù)測定。
勻漿或裂解等樣品制備步驟宜在冰浴或4℃進(jìn)行操作。
樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。

2. 試劑配制：
TBA工作液的配制： 稱取適量TBA，用TBA稀釋液配制成濃度為0.68%的TBA工作液。TBA工作液需溶解后再使用，可以加熱到60－70℃促溶，并可通過反復(fù)劇烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少3－4個月內(nèi)有效。

3. MDA檢測工作液的配制：臨檢測前，根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照)，參考下表新鮮配制適量的MDA檢測工作液。

4. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：
取適量標(biāo)準(zhǔn)品用恰當(dāng)溶液稀釋至1、2、5、10、20、50μM(如果進(jìn)行簡易快速檢測，標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋10μM)。
注意：待測樣品為血清、血漿時，標(biāo)準(zhǔn)品宜用生理鹽水稀釋；待測樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時，標(biāo)準(zhǔn)品宜用相同溶液稀釋。其原則是保證空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管具有可比性。

5. 樣品測定:
離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入0.1ml勻漿液、裂解液、PBS、生理鹽水等適當(dāng)溶液作為空白對照加入0.1ml 上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入0.1ml樣品用于測定；隨后加入4.14mlMDA檢測工作液。
注意：待測樣品為血清、血漿時，標(biāo)準(zhǔn)品宜用生理鹽水稀釋；待測樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時，標(biāo)準(zhǔn)品宜用相同溶液稀釋。

在帶蓋試管中按下表配制檢測反應(yīng)體系：

6. 混勻, 加蓋，95℃水浴煮沸40min，加熱時務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱塊(Heat block)進(jìn)行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖死的離心管或螺旋蓋離心管，或用Parafilm封住離心管口，用針頭刺一小孔。和準(zhǔn)確的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱金屬浴。
7. 水浴或流水冷卻至室溫。
8. 在3000g離心15分鐘或4000g離心10分鐘。
9. 取上清，蒸餾水調(diào)零，用分光光度計或酶標(biāo)儀檢測532nm或535nm處吸光值。如果用分光光度計，比色杯光徑應(yīng)為1cm，加入的上清量因根據(jù)比色杯的最小量程而定；如果用酶標(biāo)儀，96孔板每孔應(yīng)加200μl上清液。
如果不方便測定532nm或535nm的吸光度，也可以測定530-540nm之間的吸光度。

結(jié)果計算：
對于血漿、血清或尿液等樣品可以直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算；也可以簡易快速檢測方法，采用如果進(jìn)行簡易快速檢測，直接以10μM標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計算，獲得MDA的摩爾濃度。
對于細(xì)胞、或組織樣品，計算出樣品溶液中的MDA含量后，可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg組織。

簡易快速血清、血漿、尿液等液體樣品中MDA含量計算公式：
血清中MDA含量（umol/L）
=（測定管吸光度-空白管吸光度）÷（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×10 × 樣品測試前稀釋倍數(shù)

簡易快速細(xì)胞、組織樣品中MDA含量計算公式：
組織細(xì)胞中MDA含量（umol/mg）
=（測定管吸光度-空白管吸光度）÷（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）× 10 ÷ 樣品蛋白濃度（mg/ml）

參考取樣量：
血清（漿）尿液取0.1ml；
低密度脂蛋白懸液取0.1~0.2 ml。
食用油取0.03ml；
細(xì)胞懸液細(xì)胞上清0.1~0.2 ml。
肝組織、心肌、肌肉組織等，取5%或10%勻漿0.1~0.2 ml較好。