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學(xué)會(huì)這個(gè)多條路——離子排阻色譜的原理與實(shí)戰(zhàn)！
什么是離子排阻色譜？
離子排阻色譜又叫作離子排阻分配色譜，離子節(jié)制分配色譜。離子排阻色譜分離測定的是低電離度的分子，而不是離子，分離過程在離子交換柱上實(shí)現(xiàn)。
離子交換柱
色譜柱作為分離機(jī)制中重要的一員，承擔(dān)著固定相的角色，是我們必須了解的重點(diǎn)！
本文暫且以月旭Xtimate® Sugar-H柱為例，來闡述分離原理。該色譜柱采用磺化苯乙烯二乙烯基苯共聚氫型強(qiáng)陽離子交換填料，交聯(lián)度8%，具有耐酸、耐高溫的特點(diǎn)。樹脂中二乙烯基苯的含量影響弱酸的保留，一般而言，交聯(lián)度越低，就有越多的電解質(zhì)進(jìn)入到樹脂內(nèi)部，使弱酸的保留增強(qiáng)。
離子排阻色譜原理
由于道南電勢的存在，離子交換劑中固定不擴(kuò)散的離子可排斥帶同種電荷的小離子擴(kuò)散進(jìn)入樹脂相。被排阻的離子快速通過色譜柱，無保留或保留值很小；非離子溶質(zhì)則被分配、保留并實(shí)現(xiàn)分離。強(qiáng)酸陰離子受阻于陽離子交換樹脂之外，而低電離度的弱酸分子能夠進(jìn)入到樹脂內(nèi)部，且通過溶質(zhì)與樹脂功能團(tuán)之間的極性相互作用和溶質(zhì)與樹脂基體間的非極性相互作用被固定相所保留。
因此，在離子排阻色譜中溶質(zhì)保留的選擇性產(chǎn)生于：
溶質(zhì)受阻程度的不同，一般歸因于pKa差異，在不同的pH條件下物質(zhì)的電離程度不同。
溶質(zhì)與樹脂功能團(tuán)間極性相互作用的差異。
溶質(zhì)與樹脂基體間非極性相互作用的差異。
可通過調(diào)節(jié)柱溫改變電離平衡活躍程度，改善分離度。
實(shí)例分析
月旭Xtimate® Sugar-H（7.8×300mm，5μm）分離弱酸鈣鹽和醋酸賴氨酸，流動(dòng)相為稀硫酸溶液。在分離弱酸陰離子時(shí)，為了抑制電離，將陰離子轉(zhuǎn)化為游離的分子，使用稀酸作為流動(dòng)相。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH可改變分析物的電離程度即受阻程度，實(shí)現(xiàn)各物質(zhì)的分離。
六種分析物結(jié)構(gòu)如下
觀察以上結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)：此類分析物是連接不同R基團(tuán)的有機(jī)酸分子R-C00H，擁有不同的pKa值，在不同的pH下呈現(xiàn)不同的分子-離子平衡狀態(tài)。所以我們設(shè)想通過離子排阻色譜填料，對不同結(jié)構(gòu)的分析物產(chǎn)生的排阻情況和分配效果不同，從而達(dá)到分離，這樣的一個(gè)思路。
接下來我們嘗試不同pH流動(dòng)相的分離效果
1. 流動(dòng)相pH=1.99：
分析：僅分離五個(gè)峰，醋酸賴氨酸未分離。
2. 流動(dòng)相pH=1.69：
分析：pH減小，在色譜柱中后四峰對應(yīng)的物質(zhì)質(zhì)子化程度增強(qiáng)，電離程度減弱，低電離度的弱酸分子進(jìn)入到樹脂內(nèi)部被保留分配，后4個(gè)峰保留增強(qiáng)，醋酸賴氨酸得以分離（8.5min）。但倒數(shù)2，3峰出現(xiàn)重合，改變柱溫?zé)o更優(yōu)結(jié)果。醋酸賴氨酸8.5min后有一定空間將后四個(gè)峰左移，可能分離后四個(gè)峰。嘗試將流動(dòng)相pH調(diào)至（1.69-1.99）之間。
3. 調(diào)整流動(dòng)相pH=1.85：
分析：后四個(gè)峰太靠左，需微調(diào)pH使得峰向右移。
考察更低pH時(shí)是否能極大增強(qiáng)保留使后四峰分離。
4-1. 調(diào)整流動(dòng)相pH=1.40：
4-2. 調(diào)整流動(dòng)相pH=1.57：
分析：更低pH無法達(dá)到分離目標(biāo)。縱觀以上1-4結(jié)果，當(dāng)降低流動(dòng)相pH≦1.99時(shí)，不管pH變化為多少，后四峰保留時(shí)間均在8.5min至14min之間，僅先后次序發(fā)生改變。醋酸賴氨酸保留時(shí)間幾乎不變，處于8.5min前后。pH≦1.99時(shí)弱酸陰離子質(zhì)子化程度比較大，幾乎達(dá)到極限，可供分離的調(diào)整空間無幾。需改變思路。
當(dāng)pH升高時(shí)，調(diào)節(jié)各弱酸陰離子的電離平衡，保留一定的離子受阻率，峰保留減弱提前出峰，若醋酸賴氨酸保留時(shí)間仍不變，則可能使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中。
5. 調(diào)整流動(dòng)相pH=2.0，柱溫50度：
分析：當(dāng)pH升高時(shí)，峰保留減弱提前出峰，醋酸賴氨酸保留時(shí)間仍不變，處于8.5min，使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中的思路可行。
6. 調(diào)整流動(dòng)相pH=2.5，柱溫50度：
分析：僅分離五個(gè)峰，醋酸賴氨酸未分離。
折中取流動(dòng)相。
7-1. pH=2.3，柱溫50度和60度：
7-2. pH=2.35，柱溫50度和60度：
分析：倒數(shù)第二峰對流動(dòng)相pH敏感，且與前后峰接近，調(diào)整空間受到限制，需改變思路。
當(dāng)pH>2.0時(shí)，最末峰出峰范圍固定于9-11min。目前已知當(dāng)pH升高時(shí)，其他四種物質(zhì)出峰會(huì)提前，可以考慮將其他四個(gè)峰前移，使醋酸賴氨酸峰出在倒數(shù)第二的出峰位置。參考6的結(jié)果（pH=2.5，柱溫50度的分離情況），推測當(dāng)pH>2.5時(shí)，前4個(gè)峰前移，醋酸賴氨酸得以與重合的倒數(shù)第二個(gè)峰分離。因倒數(shù)第二峰的出峰時(shí)間對pH敏感，只能微調(diào)pH進(jìn)行嘗試。
8. 調(diào)流動(dòng)相pH=2.6，柱溫50度和60度：
分析：達(dá)到預(yù)期分離情況，分離度良好。
結(jié)論：當(dāng)我們真正了解離子排阻色譜分離原理后，就可以游刃有余的通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH、柱溫等，來改變樣品保留地選擇性。通過改變色譜條件，調(diào)節(jié)分析物的電離活躍程度，改變離子受阻率，對各個(gè)物質(zhì)進(jìn)行分離。你，學(xué)會(huì)了嗎？