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雜質(zhì)分離方法開發(fā)過(guò)程
01 分析目的要求
開發(fā)一種合適的分析方法，使上述3種化合物在濃度1.0mg/mL的情況下分離度大于1.50。
開始方法開發(fā)之前，第一件該做的事是什么呢？
當(dāng)然是去了解這幾個(gè)物質(zhì)的性質(zhì)，盡可能的得到有關(guān)這些物質(zhì)的信息，這樣可以為后面工作節(jié)省最多的時(shí)間。而對(duì)這三個(gè)物質(zhì)得到的信息大致如下：三種物質(zhì)極性比較強(qiáng)，水溶性比較好，在常規(guī)C18色譜柱保留太弱，基本上與溶劑峰重疊。結(jié)構(gòu)式上主要是官能團(tuán)的差異，分別為-NH2，-Br，-COOH，差異性很大。
綜合考慮，有兩種方案：一是加離子對(duì)試劑，用反相C18色譜柱增強(qiáng)保留，進(jìn)行分離；二是使用離子交換色譜柱進(jìn)行分離。首先由于個(gè)人的習(xí)慣，離子交換色譜被我直接排除（離子色譜平衡比較慢，而且離子交換色譜柱非常容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問(wèn)題）。所以本實(shí)驗(yàn)采用C18添加離子對(duì)試劑的方法。
考慮的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要使用離子對(duì)試劑，且流動(dòng)相pH需要大范圍調(diào)整（可能用到堿性流動(dòng)相），所以色譜柱選擇月旭Xtimate® C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流速：1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。
2.1 初步嘗試流動(dòng)相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀，PH=4.60。
結(jié)果：化合物3保留時(shí)間2.6min，化合物1不出峰。估計(jì)是化合物1保留太強(qiáng)未洗脫下來(lái)。接下來(lái)，調(diào)整pH并增加有機(jī)相的比例，來(lái)加大洗脫能力。
2.2 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：甲醇=60：40。
混合對(duì)照?qǐng)D譜如下：
實(shí)驗(yàn)中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉，增加有機(jī)相（甲醇）比例，結(jié)果三個(gè)物質(zhì)分離良好，但是化合物1（19.9分鐘）峰型太差，下一步優(yōu)化化合物1的峰型。
2.3 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：乙腈=80：20。
化合物1圖譜：
基于上一次實(shí)驗(yàn)，將有機(jī)相甲醇變?yōu)橐译妫ㄟ^(guò)改變選擇性看是否峰型會(huì)有改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有任何改善，而且發(fā)現(xiàn)這個(gè)方法中有機(jī)相只提供洗脫能力，不提供選擇性改變作用。
2.4 流動(dòng)相：緩沖液（緩沖液：1.00g十二烷基磺酸鈉，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調(diào)pH=1.80）：甲醇=60：40。
混合對(duì)照?qǐng)D譜：
當(dāng)時(shí)換成這個(gè)流動(dòng)相的主要思路是，加十二烷基磺酸鈉使保留更強(qiáng)，加氯化銨提高離子濃度，調(diào)pH至1.80強(qiáng)酸性使化合物1中-NH2官能團(tuán)作用更弱，達(dá)到優(yōu)化峰型的目的，但是效果很差。回頭總結(jié)發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質(zhì)的不同官能團(tuán)上，導(dǎo)致越走越偏離分離的軌跡，這里，三個(gè)物質(zhì)共同含有的官能團(tuán)可能也是影響分離的主要因素，換了個(gè)角度后，豁然開朗了。tui翻了之前的方案，將離子對(duì)試劑換為四丁基氫氧化銨，從頭開始。
2.5 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=9.30）：乙腈=80：20。
混合對(duì)照?qǐng)D譜：
流動(dòng)相中添加三乙胺和并將pH調(diào)成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種物質(zhì)沒(méi)有分開。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。
2.6 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=7.00）：乙腈=80：20。
混合對(duì)照?qǐng)D譜：
看到這結(jié)果是不是項(xiàng)目就OK了。但是既然是方法開發(fā)，方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是bi不可少的，需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件。
結(jié)果問(wèn)題就來(lái)了.....
化合物1圖譜：
化合物1峰型一直分叉，最終發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是色譜柱使用多種離子對(duì)試劑，造成色譜柱改性，新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果。好吧，再開始。
然后又是繼續(xù)摸索。不得不說(shuō)有時(shí)候運(yùn)氣也是成功的一部分，在一次流動(dòng)相配置過(guò)程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨，突然我就冒出想法，用四丁基溴化銨試試，不知道結(jié)果會(huì)怎么樣，說(shuō)做就做。
2.7 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20。
混合對(duì)照?qǐng)D譜：
03 結(jié)果
結(jié)果：分離度，峰型都滿足要求，wan美。當(dāng)然還是需要重現(xiàn)方法的。
三根新色譜柱重現(xiàn)結(jié)果：
最終色譜條件：
色譜柱：月旭Xtimate® C18（4.6*250mm，5μm）。
流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20
檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；
柱溫：30℃；
流速：1mL/min；
進(jìn)樣體積：10μL。
搞定交差！
04 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
在液相應(yīng)用方法開發(fā)過(guò)程中，首先需結(jié)合需要分離的目的，確定思路，一個(gè)方法最初的思路，是決定這個(gè)方法開發(fā)的效果，效率的最根本因素；其次是細(xì)節(jié)，任何細(xì)節(jié)都有可能導(dǎo)致你實(shí)驗(yàn)的成功與否；最后是運(yùn)氣，牛頓發(fā)現(xiàn)萬(wàn)有引力還有運(yùn)氣成分呢，說(shuō)不定你是下一個(gè)。
同時(shí)，在一個(gè)方法確定好之后，一定需要使用一根新的色譜柱來(lái)驗(yàn)證，因?yàn)樵诜椒ㄩ_發(fā)過(guò)程中，我們會(huì)使用到各種流動(dòng)相條件，會(huì)對(duì)色譜柱一個(gè)改性，特別是使用離子對(duì)試劑的方法，否則后續(xù)的重現(xiàn)性問(wèn)題會(huì)是一個(gè)非常頭痛的事情。