梯度洗脫在反相色譜中的作用(上篇)
梯度洗脫可用于處理不能以等度洗脫分離的樣品,而最常見的使用梯度的因素是多成分保留能力不同,無法在等度洗脫中全洗脫出來,或以等度方式無法達到滿意的分離效果。總結下來,以下幾種情況,可以采用梯度洗脫:
1、多組分樣品的極性范圍大,用等度無法全部洗脫的樣品;
2、大分子樣品;
3、改善峰峰型;
4、目標峰出峰后,短時間內提高有機相比例,洗脫強保留干擾雜質;
5、用等度洗脫無法達到分離的情況。
#01
多組分樣品的極性范圍大,
用等度無法全部洗脫
具有不同保留值范圍的多組分,無法使用同一個等度wan全洗脫下來。用同一個等度,會出現要么部分成分無保留沒法分離,部分強保留無法洗脫下來,或一針洗脫時間過久的問題,這種情況下,選擇梯度洗脫,使流動相洗脫能力從弱到強,從而達到不同保留值范圍的多組分在同一個條件下實現分離。
#02
大分子樣品
大分子量樣品(肽、蛋白質、合成聚合物等)一般采用梯度洗脫分離會更好,尤其是反相條件。這類樣品,往往對有機相的量特別敏感,有機相的微小變化就會使樣品的保留時間發生很大的變化,導致用等度條件檢測時,無法使保留時間控制在一個穩定合適的范圍內。
#03
改善峰型
有些成分,在使用等度洗脫時,峰型不佳,不能滿足檢測需求,這種時候,可以采用梯度洗脫來改善峰型。因此,哪怕是單一成分的含量測定,有時也會用到梯度洗脫進行測定。
示例:4-哌啶甲酸的檢測
由對比圖可以發現,4-哌啶甲酸成分,在使用等度洗脫時,不對稱度3.8,拖尾明顯,采用梯度洗脫后,不對稱度為1.78,拖尾現象改善明顯。