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SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒

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產(chǎn)品型號

品       牌派萃

廠商性質(zhì)生產(chǎn)商

所  在  地上海市

更新時間:2024-11-15 08:56:24瀏覽次數(shù):851次

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供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 40T
貨號 SP4001-40T 應(yīng)用領(lǐng)域 生物產(chǎn)業(yè)
主要用途 活細(xì)菌 死細(xì)菌雙染
SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒是一款方便且操作簡單的試劑盒,利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶(PI)紅色熒光核酸染料來進(jìn)行細(xì)菌活力的檢測,適用于大量的細(xì)菌種屬,包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、Staphylococcus aureus、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌等。

SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒產(chǎn)品簡介:

SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒是一款方便且操作簡單的試劑盒,利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶(PI)紅色熒光核酸染料來進(jìn)行細(xì)菌活力的檢測,適用于大量的細(xì)菌種屬,包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、Staphylococcus aureus、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和化膿性鏈球菌。

SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒的工作原理在于:SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細(xì)菌細(xì)胞的能力不同。單獨使用時,SYTO 9能對群體內(nèi)的所有細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記—具有完整膜和受損膜的細(xì)菌;相反,PI只能滲透進(jìn)入受損的膜,PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低,當(dāng)體系內(nèi)加入兩種染料時。因此,通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色,具有完整膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈綠色熒光,而具受損膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈紅色熒光。兩者染料的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別是480/500nm(SYTO 9)和 490/635nm(PI)。背景基本無熒光。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡,熒光光度計、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測儀器。

產(chǎn)品組成

編號/組分SP4001-40T規(guī)格保存方法
SP4001-ASYTO 9 Solution (3.34mM)60μl-20oC避光
SP4001-BPI Solution(20mM)60μl-20oC避光
SP4001-CMounting oil, for bacteria immobilized on membranes2ml-20oC保存


【注】組分C熒光顯微鏡檢測方法中才會應(yīng)用的到,具體用法見注意事項3)。

試劑盒規(guī)格說明(按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測試體積來計算):保存與運輸方法:-20℃避光保存,有效期一年。 冰袋運輸。

熒光顯微鏡檢測:1ml菌液加入3μl染料混合液(SYTO 1.5μl +PI 1.5μl),可做40次獨立測試。

熒光酶標(biāo)儀檢測:2ml無菌水加入12μl染料混合液(SYTO 6.0μl +PI 6.0μl),制備成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用,可做200次獨立測試。

流式細(xì)胞儀檢測:2ml菌液加入6μl染料混合液(SYTO 3.0μl +PI 3.0μl),可做20次獨立測試。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開展自身細(xì)菌樣本的染色。)

一、培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備:

【注意】:用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌染色,務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留,因為,核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合,導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液,因此可能降低染色效率。

1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus(30ml)使其生長至對數(shù)生長后期。

1.2 于10000×g離心10-15min,濃縮25ml細(xì)菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液,用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管(設(shè)置為活細(xì)菌組),用含20ml 70%異丙醇(也可以用其他方法比如高熱處理殺死細(xì)菌)的30-40ml離心管(設(shè)置為死細(xì)菌組)。

1.5 兩管樣品(分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組)于室溫孵育1h,每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品(分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組)于10000×g離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀,并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度(OD670),用玻璃或丙烯酸酯比色皿(1cm路徑)。

1.10 對于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度,根據(jù)你的儀器類型(熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)、熒光酶標(biāo)儀)或流式細(xì)胞儀來參考相應(yīng)部分的染色條件。

二、染色條件的優(yōu)化:

試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過平衡優(yōu)化,按照1:1的比例進(jìn)行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細(xì)菌。偶然情況下,兩種染料的混合比例需根據(jù)實際需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。比如:在待檢樣本中,綠色熒光太突出,建議要么降低SYTO 9濃度,要么提高PI濃度。

為了全面優(yōu)化染色條件,建議測試梯度濃度的SYTO 9,每一種濃度與梯度濃度的PI進(jìn)行組合染色。建議按照1ml細(xì)菌懸液加入3µl不同混合比率的染料預(yù)混液。

[注]:SYTO 9 +PI 對細(xì)菌的染色請按照說明書建議的15min來操作,不要超過30min。 SYTO 9有很好的細(xì)菌滲透性,我們給的實驗條件都是優(yōu)化過。 SYTO 9只有在哺乳動物細(xì)胞染色,可能會延長染色時間到120min。

由于染的是活菌+死菌的比例,請染色后盡快觀察,不要超過1h。 另,染色后基本是不用清洗的,除非覺得背景熒光很高,就是非細(xì)菌的菌體部分都能看到熒光,才有必要簡單清洗一次。

三、熒光顯微鏡操作步驟:

活菌和死菌的熒光可能用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素長通濾片設(shè)置來同時觀察。替代方案的話,活菌(綠色熒光)和死菌(紅色熒光)可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設(shè)置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征:

Omega濾光片*

Chroma濾光片*

注意事項

XF25, XF26, XF115

11001, 41012, 71010

用于同時觀察SYTO 9和PI染色的長通和雙發(fā)射濾光片

XF22, XF23

31001, 41001

僅用于觀察SYTO 9的帶通濾光片

XF32, XF43, XF102, XF108

31002, 31004, 41002, 4100

僅用于觀察PI的帶通濾光片

用于熒光顯微鏡觀察的推薦帶通濾光片。Omega濾光片由Omega Optical提供,Chroma濾光片由Chroma Technolog公司提供。

3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A(SYTO 9)和組分B(PI),混勻。

3.2 每1ml細(xì)菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù),最終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO。更高濃度的DMSO可能對染色產(chǎn)生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細(xì)菌懸液到載玻片上,并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察。

四、熒光光度計操作步驟:

4.1 調(diào)整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為1×108個細(xì)菌/ml(~0.03 OD670)或Staphylococcus aureus懸液(活和殺死)使其密度為1×107個細(xì)菌/ml(~0.15 OD670)。用于熒光光度計檢測,Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

4.2 參考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液。每個樣本的總體積為3ml。

4.3 在微量離心管內(nèi)分別加30μl組分A(SYTO 9)和30μl組分B(PI),混勻。

4.4 每組不同比例的細(xì)菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液(5個樣本×9μl =45μl總量),用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6 熒光測定和數(shù)據(jù)分析:

①用熒光光度計測定每組細(xì)菌懸液(Fcell)的熒光發(fā)射光譜(激發(fā):470nm,發(fā)射:490-700nm)

②分別測定發(fā)射光譜在510-540nm(em1,綠色)和620-650nm(em2,紅色)的累積熒光,并計算累積熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo),以累積綠色熒光與紅色熒光比(RatioG/R)為縱坐標(biāo),制圖

五、熒光酶標(biāo)儀操作步驟:

針對細(xì)菌懸液,用熒光酶標(biāo)儀的測定條件與熒光光度計的基本類似。如同熒光光度計的檢測步驟,染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度,綠/紅熒光比與活細(xì)菌相對數(shù)量呈正比。

5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為2×108個細(xì)菌/ml(~0.06 OD670)或Staphylococcus aureus懸液(活和殺死)使其密度為2×107個細(xì)菌/ml(~0.3 OD670)。用于熒光酶標(biāo)儀檢測,Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液(大腸桿菌或Staphylococcus aureus)。每個樣本的總體積為2ml。

5.3 在微量離心管內(nèi)分別加6μl組分A(SYTO 9)和6μl組分B(PI),混勻。

5.4 通過將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無菌的dH2O,混勻后制備2×染色混合液。

5.5 吸100μl細(xì)菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi),建議每個制備物做三個平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數(shù)。

5.6 更換新的槍頭,每孔加入100μl 2×染色混合液,上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8 熒光測定和數(shù)據(jù)分析:

①以~485nm為激發(fā)波長,~530nm為發(fā)射波長(emission 1,綠色)來測定每孔熒光

②以~485nm為激發(fā)波長,~630nm為發(fā)射波長(emission 2,紅色)來測定每孔熒光

③通過測定兩種發(fā)射波長下的熒光強光,并計算熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo),以RatioG/R為縱坐標(biāo),制圖

六、流式細(xì)胞儀操作步驟:

儀器的檢測配置可能要因?qū)嶋H情況來調(diào)整,但此處列出的檢測技術(shù)和設(shè)置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀。

6.1 調(diào)整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為1×108個細(xì)菌/ml(~0.03 OD670),之后用無菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個細(xì)菌/ml。

6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混11種不同比例的細(xì)菌懸液。每個樣本的總體積為2ml。

注意事項:

1由于試劑盒內(nèi)SYTO 9和PI的組分量少,室溫回溫充分融化后,務(wù)必低速離心沉至管底后再開蓋。

2兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中,所以后續(xù)無需再單獨添加,第一次使用可將SYTO 9和PI根據(jù)單次用量分裝保存,密封后置于≤-20℃避光保存。

3組分C(Mounting oil)主要應(yīng)用于熒光顯微鏡檢測法,菌液加到載玻片后,接著滴1-2滴組分C用于將細(xì)菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003。不要用作浸油(Immersion oil)。

4SYTO 9和PI結(jié)合核酸,PI是潛在的誘變劑,目前沒有數(shù)據(jù)闡明SYTO 9的誘變性或毒性,兩種試劑使用都需做恰當(dāng)防護(hù)。DMSO能促進(jìn)有機分子進(jìn)入組織。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料,含此類染料的試劑經(jīng)活性炭吸附后再進(jìn)行廢液處理?;钚蕴恐蠼?jīng)焚燒來破壞染料。

5為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。




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