EPI300 Electroporation-Competent Cell

產品規格

EPI300 Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期)：                                         -80℃（6個月）

基因型

F – mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ – rpsL nupG trfA dhfr.

產品說明

EPI300電擊感受態細胞只能用于電擊轉化，不能用于熱激轉化。EPI300細胞含有一個突變的trfA基因，該基因表達出的蛋白產物可以促進含有ori V復制子的質粒的高拷貝擴繁，誘導劑Ⅰ可以誘導trfA基因的表達。當含有ori V復制子質粒的EPI300細胞在LB/2YT或SOB培養基中生長時，trfA基因的表達被抑制，ori V復制子質粒的拷貝數維持在很低的水平；當在培養基中加入誘導劑Ⅰ，ori V復制子質粒的拷貝數可維持在很高的水平，提高了質粒產量。因此EPI300菌株可以降低ori V復制子質粒的拷貝數，特別適合于各種不穩定 DNA 或毒性基因的克隆。 [mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI300菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（例如：哺乳動物基因組DNA）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacZΔM15 標記的存在使EPI300可用于藍白斑篩選，rpsL賦予其鏈霉素抗性。此外，EPI300電擊感受態細胞轉化效率*，特別適用于文庫構建，唯地生物生產的EPI300電擊感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率>2×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的EPI300電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手打EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

    A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；

    B. 對于連接產物，大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與EPI300電擊感受態混合后電擊轉化，無             需進行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態。

    C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸，然后與EPI300電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數，也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。37℃，225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。