SPE固相萃取技術(shù)（儀器裝置）之如何建立固相萃取方法
6.如何建立固相萃取方法
6.1固相萃取基本步驟
固相萃取的步驟視萃取機(jī)理及檢測手段可多可少。對于反相固相萃取柱而言，其基本步驟有五步：
－ 固相萃取柱預(yù)處理
－ 樣品添加
－ 固相萃取柱洗滌
－ 固相萃取柱干燥
－ 目標(biāo)物洗脫
固相萃取柱預(yù)處理
無論是自行裝填的還是商品化的固相萃取柱在使用之前都是以干燥的狀態(tài)存在的。如同新購置的HPLC柱一樣，在使用時(shí)都必須先對柱子進(jìn)行活化、平衡。對于反相固相萃取柱而言，進(jìn)行柱子預(yù)處理的主要目的有兩個(gè)：
對固相柱進(jìn)行活化，展開碳?xì)滏溤黾雍头治鑫镒饔玫谋砻娣e。
對固相柱進(jìn)行清洗，除去柱上吸附的對分析有影響的雜質(zhì)。
在具體操作上，一般程序是：先用甲醇或極性有機(jī)溶劑淋洗柱子，然后再用水或緩沖溶劑除去多余的有機(jī)溶劑。因?yàn)樯鲜鲇袡C(jī)溶劑都是良好的洗脫劑，過多的存在會使目標(biāo)化合物在吸附過程中損失。當(dāng)用離子交換 SPE 時(shí), 必須注意系統(tǒng)的pH。其pH值應(yīng)該與樣品保持一致。如果使用的是手工的操作方法，必須注意在加樣于固相柱前已處理好的固相萃取柱必需保持濕潤。 這點(diǎn)對于非高聚物的固相萃取柱尤為重要。否則會出現(xiàn)回收率低、重現(xiàn)性差的結(jié)果。
SPE固相萃取技術(shù)（儀器裝置）之如何建立固相萃取方法
?樣品添加
將樣品添加于固相柱中，用正壓或負(fù)壓使樣品通過柱子。樣品的流速必須控制。慢流速有利于對目標(biāo)化合物的吸附。但是，流速過慢會增加整個(gè)萃取過程的時(shí)間，降低樣品處理的通量。另外，過慢的流速會造成雜質(zhì)被吸附的機(jī)會增加，對目標(biāo)化合物的檢測分析不利。 一般對于100毫克填料的SPE柱流速在5-10 ml/min。對于以離子交換為作用機(jī)理的萃取，樣品通過SPE柱的速度應(yīng)該適當(dāng)?shù)慕档停员ＷC分析物有足夠的時(shí)間與SPE柱填料的離子交換功能團(tuán)發(fā)生作用一般控制在1.5-5 ml/min。
固相萃取柱洗滌
為了減少分析時(shí)雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾，延長儀器的使用壽命，應(yīng)該盡可能地除去干擾物。因此，在固相萃取中經(jīng)常會通過對固相萃取柱的洗滌來達(dá)到這個(gè)目的。選用適當(dāng)?shù)南礈靹┻x擇性地洗脫吸附力弱雜質(zhì)而保留分析物于柱上。洗滌劑的選擇也取決于zui后的分析手段。不同的檢測手段對樣品的“干凈"程度也不同。
固相萃取柱干燥
如zui后的洗脫劑為緩沖溶液或水溶性有機(jī)溶劑，而分析手段為反相 HPLC，固相柱上的殘留水對分析影響不大。但是，當(dāng)水溶性差的有機(jī)溶劑為洗脫劑或分析手段為GC或GC-MS時(shí)，固相萃取柱的干燥就特別重要。水溶性差的有機(jī)溶劑作為目標(biāo)物的洗脫溶液時(shí)，水的存在會直接影響洗脫效率。而樣品中大量水分的存在將對GC分析柱造成致命性的損害。
目標(biāo)物洗脫
目標(biāo)化合物的洗脫在整個(gè)固相萃取過程中是至關(guān)重要的zui后一步。為了zui大限度地將目標(biāo)化合物洗脫下來，必須選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇＿x擇洗脫溶劑時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素：
洗脫劑必需有足夠強(qiáng)度，以zui小用量將分析物洗脫下來。洗脫劑必需有足夠的選擇性只將分析物洗脫，而將吸附力強(qiáng)的雜質(zhì)保留在柱上。
在選擇洗脫溶劑時(shí)，可以通過改變?nèi)軇┑臉O性指數(shù)、溶劑強(qiáng)度、溶劑選擇性來達(dá)到的分離效果。
洗脫溶劑通過柱子的流速也必須控制。流速慢有利于目標(biāo)化合物的洗脫。但是，會增加萃取時(shí)間，降低效率；同時(shí)，過慢的流速可能會造成zui后洗脫餾分中雜質(zhì)的增加，對檢測分析不利。
6.2相關(guān)信息的匯集
要建立一個(gè)好的固相萃取方法應(yīng)該綜合考慮許多因素。其中首先要做的就是匯集所有可能得到的信息。這些信息主要包括：
目標(biāo)化合物
－ 化學(xué)結(jié)構(gòu)
－ 可生成離子化合物的pKa
－ 濃度
－ 估計(jì)樣品體積
－ 溶解度
－ 穩(wěn)定性
樣品基質(zhì)
－ 基質(zhì)的類型
－ pH值及離子強(qiáng)度
－ 對目標(biāo)化合物萃取的干擾
分析手段
－ zui終的分析手段
－ 分析方法可使用的溶劑
－ 現(xiàn)有的HPLC方法
在具體實(shí)施中可以通過填寫下列表格來確定初步的固相萃取參數(shù)：
SPE固相萃取技術(shù)（儀器裝置）之如何建立固相萃取方法?
6.3固相萃取材料的選擇
在選擇固相萃取柱時(shí)，首先要考慮的是選擇哪種萃取機(jī)理對目標(biāo)化合物進(jìn)行萃取。以下是根據(jù)萃取機(jī)理選擇萃取填料類型的示意圖：
根據(jù)化合物的lg Kow選擇固相萃取材料
辛醇-水分配系數(shù) Kow 是有機(jī)化合物在辛醇和水兩相平衡濃度比，Kow反映了該有機(jī)化合物的親脂性或親水性的程度。在固相萃取中，可以根據(jù) lg Kow 的大小來選擇固相萃取柱。通常，lg Kow >3為非極性化合物；lg Kow在1-3之間為中等極性化合物；lg Kow <1為極性化合物；lg Kow <0為水溶性化合物。
6.4選擇固相萃取溶劑
溶劑的選擇一般包括兩個(gè)方面：洗滌溶劑的選擇和洗脫溶劑的選擇。
對于洗滌溶劑而言，我們希望的洗滌溶劑能夠zui大限度地將可能對目標(biāo)化合物分析及對檢測儀器帶來干擾及損害的物質(zhì)除去。同時(shí)，又能zui大限度地保證分析物在洗滌過程中不會有明顯的損失。下表是選擇洗滌溶液的一些基本原則。
洗脫溶液用于將目標(biāo)化合物從固相萃取柱上洗脫下來。
固相萃取中常見溶劑的性質(zhì)
?
6.5選擇固相萃取的流速
在固相萃取過程中，有三個(gè)步驟涉及到液體通過固相萃取柱的流速：樣品過柱、洗滌及洗脫。其中，樣品過柱的流速及洗脫液過柱的流速對結(jié)果的影響較大。
樣品過柱的流速的選擇可以參考下表：
洗脫溶劑的流速與洗脫溶劑的用量有關(guān)。溶劑用量大，溶劑過柱的流速可以加快。但是一般的洗脫原則是洗脫溶劑的體積越小越好。因?yàn)橄疵撊軇w積小，有利于洗脫物的后處理。如減少濃縮時(shí)間或無需濃縮。對于以硅膠為基質(zhì)的固相萃取柱，洗脫溶劑的用量及其過柱的流速可以參考下表：
SPE固相萃取技術(shù)（儀器裝置）(八)之如何建立固相萃取方法
參考資料：杭州聚同電子有限公司
SPE固相萃取技術(shù)（儀器裝置）(九)之固相萃取參數(shù)的優(yōu)化
7. 固相萃取參數(shù)的優(yōu)化
在建立了初步的固相萃取方法后就可以用空白樣品添加目標(biāo)化合物后對添加物進(jìn)行萃取。然后，根據(jù)分析結(jié)果對初步的固相萃取方法進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到zuijia的效果。優(yōu)化過程主要考慮的因素有：
回收率是否達(dá)到檢測要求？
能否將萃取過程縮短以提率？
能否將溶劑使用量減少以節(jié)省成本、提率、減少污染？
如果檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率較低，應(yīng)該首先檢查整個(gè)操作過程是否有錯(cuò)。如果沒有，就要從方法本身查找原因了。可以從以下幾個(gè)方面著手檢查：
1. 洗滌溶劑是否合適
－ 理想的洗滌溶劑是溶于基質(zhì)，但對目標(biāo)物溶解度低。
2.目標(biāo)化合物是否沒有*洗脫
－ 選擇更強(qiáng)的洗脫溶劑（如改變pH、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑%含量）
－ 選擇作用力相對較弱的SPE柱
3.目標(biāo)化合物是否沒有被*吸附
可以采用原萃取方法以雙柱疊加的方式將兩個(gè)性質(zhì)相同的固相萃取柱串連在一起進(jìn)行柱子預(yù)處理及樣品添加操作，然后將兩根柱子分開，分別對兩根萃取柱洗脫。如果在下方的柱子上發(fā)現(xiàn)有目標(biāo)化合物就表明目標(biāo)化合物在萃取過程發(fā)生了穿透。也就是說目標(biāo)化合物在樣品添加過秤中沒有按照方法設(shè)計(jì)要求不很好地吸附。有部分目標(biāo)化合物在樣品添加過程中隨樣品基質(zhì)穿過固相萃取柱。發(fā)生穿透的原因可能是：萃取機(jī)理選擇的不合適；固相萃取柱的吸附容量不夠。目標(biāo)化合物沒有被*吸附還有另外一種可能性就是對于某些樣品來說，由于部分目標(biāo)化合物沒有呈游離狀態(tài)。如生物樣品中的目標(biāo)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，所以隨著樣品基質(zhì)通過固相萃取柱。
4、目標(biāo)化合物與固相萃取填料功能團(tuán)之間的吸附作用過強(qiáng)
洗脫溶劑的洗脫強(qiáng)度不足以將目標(biāo)化合物全部洗脫下來。這種情況可以改用吸附力較弱的固相萃取柱或改用洗脫強(qiáng)度更大地溶劑進(jìn)行洗脫。
在達(dá)到預(yù)期回收率的前提下，我們希望萃取過程越短越好。提率可以從以下幾個(gè)方面入手：
1、提高流速。包括預(yù)處理溶液流速、樣品過柱流速。
2、減少洗脫溶液的體積
放射性同位素法優(yōu)化固相萃取參數(shù)
在有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以通過放射性標(biāo)記物來查找回收率偏低的原因，優(yōu)化固相萃取參數(shù)。通過同位素示蹤的方法可以快速查出回收率偏低的原因，從而優(yōu)化固相萃取參數(shù)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化固相萃取參數(shù)
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或相關(guān)的軟件（如：Design of Experiment, DOE）可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，加快固相萃取方法的建立與參數(shù)的優(yōu)化。
8.基質(zhì)分散 固相萃取 (MSPD)
基質(zhì)分散固相萃取原理與操作
基質(zhì)固相分散萃取（Matrix Solid Phase Dispersion, MSPD）是Barker等人在1989年提出，并將其應(yīng)用于哺乳動物組織中目標(biāo)化合物的萃取。如下所示，與經(jīng)典的固相萃取裝置不同，MSPD萃取是將樣品與固相吸附劑（C18、硅膠等）一起研磨之后，使樣品成為微小的碎片分散在固相吸附劑表面。然后將此混合物裝入空的SPE柱或注射針筒，用適當(dāng)?shù)娜軇⒛繕?biāo)化合物洗脫下來。
基質(zhì)固相分散萃取的主要優(yōu)點(diǎn)是：適用于固體、半固體及粘稠樣品的萃取；萃取溶劑與目標(biāo)化合物的接觸面增大，有利于目標(biāo)化合物的萃取；溶劑*滲入樣品基質(zhì)中，提高了萃取效率；使用的萃取溶劑比傳統(tǒng)的LLE減少約95%，而且所需樣品量小、萃取速度也比LLE快約90%。
經(jīng)典的基質(zhì)固相分散萃取是將2 g 固體吸附劑放入無孔的玻璃、鋁或瑪瑙研磨盆中，并將0.5 g 或0.5 mL樣品倒在載體上面。然后用磨棒進(jìn)行溫和的研磨，大約30 sec~45 sec樣品基本分散在載體表面。
將研磨好的樣品/吸附劑轉(zhuǎn)移至有塞片或?yàn)V紙的空SPE柱或玻璃注射針筒中，也可以根據(jù)需要將樣品/吸附劑轉(zhuǎn)移至裝有吸附劑的SPE柱（例如，氟羅里硅土SPE柱）中。氟羅里硅土SPE柱的作用是吸附基質(zhì)固相分散萃取共流出干擾物以達(dá)到樣品凈化的目的。也可以將基質(zhì)固相分散萃取柱疊加在SPE凈化柱之上進(jìn)行洗脫。干燥的氟羅里硅土不但可以對基質(zhì)固相分散萃取洗脫物進(jìn)行凈化，還可以除去洗脫物中的水分。通常每種洗滌或洗脫溶液的用量為8 mL。洗脫可以利用重力進(jìn)行，為了提高樣品處理的通量，也可以加以真空或正壓。洗脫通常是用不同的溶劑按一定的順序進(jìn)行，可以按照溶劑的極性大小，由低極性至高極性順序洗脫，分別收集每個(gè)溶劑組分。例如按照正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水的順序洗脫。為了減少雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾，有時(shí)也需要對萃取柱進(jìn)行洗滌或?qū)腿∥镞M(jìn)行進(jìn)一步的凈化。
9.分散 固相萃取 (d-SPE)
分散固相萃取（dispersive solid phase extraction, d-SPE）與基質(zhì)固相分散萃取有相同之處，兩者都是使用分散的固相萃取吸附劑而不是經(jīng)典的固相萃取柱對樣品進(jìn)行萃取。但是，與基質(zhì)固相分散萃取不同，d-SPE是將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品的萃取液中，而不是直接加入到原始樣品中。d-SPEzui典型的應(yīng)用就是在多農(nóng)藥殘留檢測中使用的QuEChERS樣品前處理方法。
QuEChERS萃取方法
QuEChERS (發(fā)音：catchers) 是英文 Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safty的縮寫。即為：“快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全"的萃取方法。該方法是Anastassiades等人于2002年在首先在EPRW會議提出，并于2003年正式發(fā)表的一個(gè)用于農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留物分析的前處理方法。Anastassiades等人zui初旨在針對水果、蔬菜、谷物等低脂農(nóng)產(chǎn)品而建立一個(gè)快速、低花費(fèi)的多農(nóng)藥殘留物樣品前處理方法。d-SPE在該方法中被應(yīng)用于除去樣品中的雜質(zhì)干擾物。該方法已經(jīng)得到AOAC和歐盟農(nóng)殘監(jiān)測委員會的認(rèn)可，并且在食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室得到廣泛的使用。
參考資料：杭州聚同電子有限公司
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