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液相色譜原理和操作詳解
北京國譜科技液相色譜
我國藥典收載液相色譜法項目和數量比較表：
方法 | 項目 | 數量 | |||
1985年版 | 1990年版 | 1995年版 | 2000年版 | ||
HPLC法 | 鑒別 | 9 | 34 | 150 | |
檢查 | 12 | 40 | 160 | ||
含量測定 | 7 | 60 | 117 | 387 | |
鑒于HPLC應用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應該掌握并應用HPLC。
I．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法zui早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
二、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到*分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用zui廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 | 反相色譜法 | |
固定相極性 | 高～中 | 中～低 |
流動相極性 | 低～中 | 中～高 |
組分洗脫次序 | 極性小先洗出 | 極性大先洗出 |
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。
分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。
II．基本概念和理論
一、基本概念和術語
1．色譜圖和峰參數
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
?基線(base line)——經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
?噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線上峰的起點至終點的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的zui高點至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標準偏差(standard deviation，σ)——正態分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數（保留值）
?死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
?死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
?調整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數
?理論塔板數(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數
?分配系數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數 （或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質量分配系數。
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數或容量因子之比。α＝＝ （設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為*分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數有如下關系：
R＝××
其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的zui容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：
1） 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內*服從分配定律，并很快達到分配平衡。
2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。
3） 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。
雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數（峰高h和峰面積A）
根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。
三、速率理論（又稱隨機模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。
2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。
3）傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。
①流動相傳質阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產生峰展寬。
②靜態流動相傳質阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一*線速度uopt，在此線速度時，Hzui小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。
3．柱外效應
速率理論研究的是柱內峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭"連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。
柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經典LC中則影響相對較小。
III．HPLC系統
HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。
目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有北京國譜科技有限公司、大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
一、輸液泵
1．泵的構造和性能
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10 ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。
各品牌輸液泵的基本參數：
項目 | Waters 515型 | HP 1100型 | LC-10ATvp型 | Elite P200 II型 | 檢定要求 |
流速范圍 | 0.001~10 | 0.001~10 | 0.001~9.999 | 0.01~4.99 | |
調節精度 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.01 | |
流量精密度 | RSD 0.1% | 0.15%（<0.3%） | 0.3% | 0.5% | 1.5% |
流量準確度 | ±2.0% | ±5.0% | ±2.0% | ||
zui高壓力 | 4000 Psi | 40 MPa | 39.2 MPa | 40.0 MPa | |
密封圈壽命 | |||||
流動相的脈沖 |
2．泵的使用和維護注意事項
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：
①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。
②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，zui終產生漏液。
④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。
⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：
①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3．梯度洗脫
HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。
梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。
在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣，以防止混合時產生氣泡。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到*平衡。
二、進樣器
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。
2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（zui多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用*裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。
六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的zui大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
4．自動進樣。用于大量樣品的常規分析。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。
1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。
2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC-MS聯用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。
3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
② 應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置時間過長或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。
四、檢測器
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。
2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。
3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標
1）噪音和漂移：在儀器穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。
4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
幾種檢測器的主要性能：
UV | 熒光 | 安培 | 質譜 | 蒸發光散射 | |
信號 | 吸光度 | 熒光強度 | 電流 | 離子流強度 | 散射光強 |
噪音 | 10-5 | 10-3 | 10-9 | ||
線性范圍 | 105 | 104 | 105 | 寬 | |
選擇性 | 是 | 是 | 是 | 否 | 否 |
流速影響 | 無 | 無 | 有 | 無 | |
溫度影響 | 小 | 小 | 大 | 小 | |
檢測限(g/ml) | 10-10 | 10-13 | 10-13 | ＜10-9g/s | 10-9 |
池體積(µl) | 2~10 | ~7 | ＜1 | —— | —— |
梯度洗脫 | 適宜 | 適宜 | 不宜 | 適宜 | 適宜 |
細管徑柱 | 難 | 難 | 適宜 | 適宜 | 適宜 |
樣品破壞 | 無 | 無 | 無 | 有 | 無 |
5）池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測器(ultraviolet detector)
UV檢測器是HPLC中應用zui廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。
中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率，E為吸收系數。
UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測器有關的故障及其排除
1）流動池內有氣泡
如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀“峰"，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。
2）流動池被污染
無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現故障
紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。
五、數據處理和計算機控制系統
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩沖劑）加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
IV．固定相和流動相
在色譜分析中，如何選擇*的色譜條件以實現分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一。本章著重討論填料基質、化學鍵合固定相和流動相的性質及其選擇。
一、基質（擔體）
HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，zui終使柱效降低。
1．基質的種類
1）硅膠
硅膠是HPLC填料中zui普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。
硅膠的主要性能參數有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；后者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。
2）氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，并顯示出的pH穩定性。
3）聚合物
以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。
所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。
2．基質的選擇
硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
硅膠 | 氧化鋁 | 苯乙烯-二乙烯苯 | 甲基丙烯酸酯 | |
耐有機溶劑 | +++ | +++ | ++ | ++ |
適用pH范圍 | + | ++ | +++ | ++ |
抗膨脹/收縮 | +++ | +++ | + | + |
耐壓 | +++ | +++ | ++ | + |
表面化學性質 | +++ | + | ++ | +++ |
效能 | +++ | ++ | + | + |
注：+++好 ++一般 +差
二、化學鍵合固定相
將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。
1．鍵合相的性質
目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。
殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用*基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的“濕潤"性能。
由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。
pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。
2．鍵合相的種類
化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。
常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。
常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用zui廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。
另外C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。
3．固定相的選擇
分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。
分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
另外，美國藥典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相
1．流動相的性質要求
一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。
選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：
①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。
反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜zui常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優于甲醇-水系統。
在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。
參考資料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價格是甲醇的6~7倍。
反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇
C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。
3．流動相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
4．流動相的脫氣
HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。
離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（系統內）脫氣法無此缺點。zui常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動相的濾過
所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過"）。
用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存
流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
8．HPLC用水
HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。
進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。
I類水標準：
NCCLS | ASTM | |
電阻率，MΩ·cm，25℃，zui小 | 10.0 | 18.0 |
硅酸鹽，mg/L，zui大 | 0.05 | 0.003 |
微粒，µm濾器 | 0.22 | 0.2 |
微生物，CFU/ml | 10 | 分三檔 |
美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標準蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。
V．HPLC應用
一、樣品測定
1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議*次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。
2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。
3．記錄時間：*次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。
4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統采用定量環（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）
5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。
6．儀器的使用：
①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。
②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。
③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。
④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。
⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗24小時（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。
⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統，則應更換水）。
二、方法研究
1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如zui靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。
2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。
附件：液相色譜法（HPLC）復核細則
一、對起草單位的要求：
1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。
2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。
3．建立方法時，應考慮下列事項：
①填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。
②流動相甲醇-水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。
③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。
④內標物應易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。
⑤檢測器UV檢測器。
4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。
5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。
二、對復核單位的要求：
1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。
2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行zui低撿出量試驗。
3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。
儀器操作：
- 開機，啟動裝置，進入win2000；開啟LC，點擊Instrumentl online 圖標，進入儀器控制面板，設置所需各項參數。
- 設置分析用流動相清洗流路，等待色譜柱、系統的平衡，基線穩定，開始進樣分析。
- 分析結束，數據處理。
- 關閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關閉脫氣機、泵，關閉整個裝置。
- 關閉總電源，記錄使用情況。
配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣后的對照（含量已標定），打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥。
高 效 液 相 色 譜
我國藥典收載液相色譜法項目和數量比較表：
方法 | 項目 | 數量 | |||
1985年版 | 1990年版 | 1995年版 | 2000年版 | ||
HPLC法 | 鑒別 | 9 | 34 | 150 | |
檢查 | 12 | 40 | 160 | ||
含量測定 | 7 | 60 | 117 | 387 | |
鑒于HPLC應用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應該掌握并應用HPLC。
I．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法zui早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
二、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到*分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用zui廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 | 反相色譜法 | |
固定相極性 | 高～中 | 中～低 |
流動相極性 | 低～中 | 中～高 |
組分洗脫次序 | 極性小先洗出 | 極性大先洗出 |
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。
分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。
II．基本概念和理論
一、基本概念和術語
1．色譜圖和峰參數
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
?基線(base line)——經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
?噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線上峰的起點至終點的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的zui高點至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標準偏差(standard deviation，σ)——正態分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數（保留值）
?死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
?死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
?調整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數
?理論塔板數(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數
?分配系數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數 （或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質量分配系數。
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數或容量因子之比。α＝＝ （設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為*分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數有如下關系：
R＝××
其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的zui容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：
1） 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內*服從分配定律，并很快達到分配平衡。
2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。
3） 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。
雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數（峰高h和峰面積A）
根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。
三、速率理論（又稱隨機模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。
2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。
3）傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。
①流動相傳質阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產生峰展寬。
②靜態流動相傳質阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一*線速度uopt，在此線速度時，Hzui小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。
3．柱外效應
速率理論研究的是柱內峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭"連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。
柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經典LC中則影響相對較小。
III．HPLC系統
HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。
目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有北京國譜科技有限公司、大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
一、輸液泵
1．泵的構造和性能
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10 ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。
各品牌輸液泵的基本參數：
項目 | Waters 515型 | HP 1100型 | LC-10ATvp型 | Elite P200 II型 | 檢定要求 |
流速范圍 | 0.001~10 | 0.001~10 | 0.001~9.999 | 0.01~4.99 | |
調節精度 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.01 | |
流量精密度 | RSD 0.1% | 0.15%（<0.3%） | 0.3% | 0.5% | 1.5% |
流量準確度 | ±2.0% | ±5.0% | ±2.0% | ||
zui高壓力 | 4000 Psi | 40 MPa | 39.2 MPa | 40.0 MPa | |
密封圈壽命 | |||||
流動相的脈沖 |
2．泵的使用和維護注意事項
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：
①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。
②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵24小時或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，zui終產生漏液。
④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。
⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：
①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3．梯度洗脫
HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。
梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。
在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣，以防止混合時產生氣泡。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到*平衡。
二、進樣器
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。
2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（zui多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用*裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。
六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的zui大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
4．自動進樣。用于大量樣品的常規分析。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。
1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。
2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC-MS聯用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。
3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
② 應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置24小時或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。
四、檢測器
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。
2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。
3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標
1）噪音和漂移：在儀器穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。
4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
幾種檢測器的主要性能：
UV | 熒光 | 安培 | 質譜 | 蒸發光散射 | |
信號 | 吸光度 | 熒光強度 | 電流 | 離子流強度 | 散射光強 |
噪音 | 10-5 | 10-3 | 10-9 | ||
線性范圍 | 105 | 104 | 105 | 寬 | |
選擇性 | 是 | 是 | 是 | 否 | 否 |
流速影響 | 無 | 無 | 有 | 無 | |
溫度影響 | 小 | 小 | 大 | 小 | |
檢測限(g/ml) | 10-10 | 10-13 | 10-13 | ＜10-9g/s | 10-9 |
池體積(µl) | 2~10 | ~7 | ＜1 | —— | —— |
梯度洗脫 | 適宜 | 適宜 | 不宜 | 適宜 | 適宜 |
細管徑柱 | 難 | 難 | 適宜 | 適宜 | 適宜 |
樣品破壞 | 無 | 無 | 無 | 有 | 無 |
5）池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測器(ultraviolet detector)
UV檢測器是HPLC中應用zui廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。
中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率，E為吸收系數。
UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測器有關的故障及其排除
1）流動池內有氣泡
如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀“峰"，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。
2）流動池被污染
無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現故障
紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。
五、數據處理和計算機控制系統
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩沖劑）加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
IV．固定相和流動相
在色譜分析中，如何選擇*的色譜條件以實現分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一。本章著重討論填料基質、化學鍵合固定相和流動相的性質及其選擇。
一、基質（擔體）
HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，zui終使柱效降低。
1．基質的種類
1）硅膠
硅膠是HPLC填料中zui普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。
硅膠的主要性能參數有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；后者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。
2）氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，并顯示出的pH穩定性。
3）聚合物
以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。
所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。
2．基質的選擇
硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
硅膠 | 氧化鋁 | 苯乙烯-二乙烯苯 | 甲基丙烯酸酯 | |
耐有機溶劑 | +++ | +++ | ++ | ++ |
適用pH范圍 | + | ++ | +++ | ++ |
抗膨脹/收縮 | +++ | +++ | + | + |
耐壓 | +++ | +++ | ++ | + |
表面化學性質 | +++ | + | ++ | +++ |
效能 | +++ | ++ | + | + |
注：+++好 ++一般 +差
二、化學鍵合固定相
將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。
1．鍵合相的性質
目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。
殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用*基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的“濕潤"性能。
由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。
pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。
2．鍵合相的種類
化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。
常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。
常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用zui廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。
另外C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。
3．固定相的選擇
分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。
分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
另外，美國藥典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相
1．流動相的性質要求
一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。
選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：
①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。
反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜zui常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優于甲醇-水系統。
在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。
參考資料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價格是甲醇的6~7倍。
反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇
C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。
3．流動相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
4．流動相的脫氣
HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。
離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（系統內）脫氣法無此缺點。zui常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動相的濾過
所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過"）。
用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存
流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
8．HPLC用水
HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。
進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。
I類水標準：
NCCLS | ASTM | |
電阻率，MΩ·cm，25℃，zui小 | 10.0 | 18.0 |
硅酸鹽，mg/L，zui大 | 0.05 | 0.003 |
微粒，µm濾器 | 0.22 | 0.2 |
微生物，CFU/ml | 10 | 分三檔 |
美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標準蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。
V．HPLC應用
一、樣品測定
1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議*次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。
2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。
3．記錄時間：*次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。
4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統采用定量環（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）
5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。
6．儀器的使用：
①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。
②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。
③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。
④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。
⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。
⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統，則應更換水）。
二、方法研究
1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如zui靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。
2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。
附件：液相色譜法（HPLC）復核細則
一、對起草單位的要求：
1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。
2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。
3．建立方法時，應考慮下列事項：
①填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。
②流動相甲醇-水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。
③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。
④內標物應易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。
⑤檢測器UV檢測器。
4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。
5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。
二、對復核單位的要求：
1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。
2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行zui低撿出量試驗。
3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。
儀器操作：
- 開機，啟動裝置，進入win2000；開啟LC，點擊Instrumentl online 圖標，進入儀器控制面板，設置所需各項參數。
- 設置分析用流動相清洗流路，等待色譜柱、系統的平衡，基線穩定，開始進樣分析。
北京國譜科技液相色譜
我國藥典收載液相色譜法項目和數量比較表：
方法
項目
數量
1985年版
1990年版
1995年版
2000年版
HPLC法
鑒別
9
34
150
檢查
12
40
160
含量測定
7
60
117
387
鑒于HPLC應用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應該掌握并應用HPLC。
I．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法zui早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
二、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到*分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用zui廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。
分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。
II．基本概念和理論
一、基本概念和術語
1．色譜圖和峰參數
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
?基線(base line)——經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
?噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線上峰的起點至終點的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的zui高點至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標準偏差(standard deviation，σ)——正態分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數（保留值）
?死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
?死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
?調整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數
?理論塔板數(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數
?分配系數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數 （或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質量分配系數。
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數或容量因子之比。α＝＝ （設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為*分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數有如下關系：
R＝××
其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的zui容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：
1） 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內*服從分配定律，并很快達到分配平衡。
2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。
3） 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。
雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數（峰高h和峰面積A）
根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。
三、速率理論（又稱隨機模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。
2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。
3）傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。
①流動相傳質阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產生峰展寬。
②靜態流動相傳質阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一*線速度uopt，在此線速度時，Hzui小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。
3．柱外效應
速率理論研究的是柱內峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭"連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。
柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經典LC中則影響相對較小。
III．HPLC系統
HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。
目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有北京國譜科技有限公司、大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
一、輸液泵
1．泵的構造和性能
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10 ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。
各品牌輸液泵的基本參數：
項目
Waters 515型
HP 1100型
LC-10ATvp型
Elite P200 II型
檢定要求
流速范圍
0.001~10
0.001~10
0.001~9.999
0.01~4.99
調節精度
0.001
0.001
0.001
0.01
流量精密度
RSD 0.1%
0.15%（<0.3%）
0.3%
0.5%
1.5%
流量準確度
±2.0%
±5.0%
±2.0%
zui高壓力
4000 Psi
40 MPa
39.2 MPa
40.0 MPa
密封圈壽命
流動相的脈沖
2．泵的使用和維護注意事項
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：
①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。
②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，zui終產生漏液。
④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。
⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：
①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3．梯度洗脫
HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。
梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。
在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣，以防止混合時產生氣泡。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到*平衡。
二、進樣器
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。
2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（zui多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用*裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。
六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的zui大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
4．自動進樣。用于大量樣品的常規分析。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。
1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。
2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC-MS聯用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。
3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
② 應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置時間過長或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。
四、檢測器
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。
2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。
3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標
1）噪音和漂移：在儀器穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。
4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
幾種檢測器的主要性能：
UV
熒光
安培
質譜
蒸發光散射
信號
吸光度
熒光強度
電流
離子流強度
散射光強
噪音
10-5
10-3
10-9
線性范圍
105
104
105
寬
選擇性
是
是
是
否
否
流速影響
無
無
有
無
溫度影響
小
小
大
小
檢測限(g/ml)
10-10
10-13
10-13
＜10-9g/s
10-9
池體積(µl)
2~10
~7
＜1
——
——
梯度洗脫
適宜
適宜
不宜
適宜
適宜
細管徑柱
難
難
適宜
適宜
適宜
樣品破壞
無
無
無
有
無
5）池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測器(ultraviolet detector)
UV檢測器是HPLC中應用zui廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。
中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率，E為吸收系數。
UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測器有關的故障及其排除
1）流動池內有氣泡
如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀“峰"，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。
2）流動池被污染
無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現故障
紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。
五、數據處理和計算機控制系統
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩沖劑）加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
IV．固定相和流動相
在色譜分析中，如何選擇*的色譜條件以實現分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一。本章著重討論填料基質、化學鍵合固定相和流動相的性質及其選擇。
一、基質（擔體）
HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，zui終使柱效降低。
1．基質的種類
1）硅膠
硅膠是HPLC填料中zui普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。
硅膠的主要性能參數有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；后者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。
2）氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，并顯示出的pH穩定性。
3）聚合物
以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。
所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。
2．基質的選擇
硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
硅膠
氧化鋁
苯乙烯-二乙烯苯
甲基丙烯酸酯
耐有機溶劑
+++
+++
++
++
適用pH范圍
+
++
+++
++
抗膨脹/收縮
+++
+++
+
+
耐壓
+++
+++
++
+
表面化學性質
+++
+
++
+++
效能
+++
++
+
+
注：+++好 ++一般 +差
二、化學鍵合固定相
將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。
1．鍵合相的性質
目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。
殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用*基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的“濕潤"性能。
由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。
pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。
2．鍵合相的種類
化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。
常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。
常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用zui廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。
另外C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。
3．固定相的選擇
分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。
分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
另外，美國藥典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相
1．流動相的性質要求
一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。
選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：
①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。
反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜zui常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優于甲醇-水系統。
在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。
參考資料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價格是甲醇的6~7倍。
反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇
C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。
3．流動相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
4．流動相的脫氣
HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。
離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（系統內）脫氣法無此缺點。zui常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動相的濾過
所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過"）。
用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存
流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
8．HPLC用水
HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。
進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。
I類水標準：
NCCLS
ASTM
電阻率，MΩ·cm，25℃，zui小
10.0
18.0
硅酸鹽，mg/L，zui大
0.05
0.003
微粒，µm濾器
0.22
0.2
微生物，CFU/ml
10
分三檔
美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標準蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。
V．HPLC應用
一、樣品測定
1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議*次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。
2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。
3．記錄時間：*次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。
4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統采用定量環（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）
5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。
6．儀器的使用：
①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。
②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。
③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。
④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。
⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗24小時（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。
⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統，則應更換水）。
二、方法研究
1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如zui靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。
2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。
附件：液相色譜法（HPLC）復核細則
一、對起草單位的要求：
1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。
2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。
3．建立方法時，應考慮下列事項：
①填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。
②流動相甲醇-水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。
③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。
④內標物應易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。
⑤檢測器UV檢測器。
4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。
5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。
二、對復核單位的要求：
1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。
2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行zui低撿出量試驗。
3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。
儀器操作：
- 開機，啟動裝置，進入win2000；開啟LC，點擊Instrumentl online 圖標，進入儀器控制面板，設置所需各項參數。
- 設置分析用流動相清洗流路，等待色譜柱、系統的平衡，基線穩定，開始進樣分析。
- 分析結束，數據處理。
- 關閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關閉脫氣機、泵，關閉整個裝置。
- 關閉總電源，記錄使用情況。
配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣后的對照（含量已標定），打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥。
高 效 液 相 色 譜
我國藥典收載液相色譜法項目和數量比較表：
方法
項目
數量
1985年版
1990年版
1995年版
2000年版
HPLC法
鑒別
9
34
150
檢查
12
40
160
含量測定
7
60
117
387
鑒于HPLC應用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應該掌握并應用HPLC。
I．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法zui早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。
二、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到*分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用zui廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。
分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。
II．基本概念和理論
一、基本概念和術語
1．色譜圖和峰參數
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
?基線(base line)——經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
?噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線上峰的起點至終點的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的zui高點至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標準偏差(standard deviation，σ)——正態分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數（保留值）
?死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
?死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
?調整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數
?理論塔板數(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數
?分配系數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數 （或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質量分配系數。
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數或容量因子之比。α＝＝ （設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為*分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數有如下關系：
R＝××
其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的zui容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：
1） 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內*服從分配定律，并很快達到分配平衡。
2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。
3） 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。
雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數（峰高h和峰面積A）
根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。
三、速率理論（又稱隨機模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。
2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。
3）傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。
①流動相傳質阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產生峰展寬。
②靜態流動相傳質阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一*線速度uopt，在此線速度時，Hzui小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。
3．柱外效應
速率理論研究的是柱內峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭"連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。
柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經典LC中則影響相對較小。
III．HPLC系統
HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。
目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有北京國譜科技有限公司、大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
一、輸液泵
1．泵的構造和性能
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10 ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。
各品牌輸液泵的基本參數：
項目
Waters 515型
HP 1100型
LC-10ATvp型
Elite P200 II型
檢定要求
流速范圍
0.001~10
0.001~10
0.001~9.999
0.01~4.99
調節精度
0.001
0.001
0.001
0.01
流量精密度
RSD 0.1%
0.15%（<0.3%）
0.3%
0.5%
1.5%
流量準確度
±2.0%
±5.0%
±2.0%
zui高壓力
4000 Psi
40 MPa
39.2 MPa
40.0 MPa
密封圈壽命
流動相的脈沖
2．泵的使用和維護注意事項
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：
①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。
②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵24小時或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，zui終產生漏液。
④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。
⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：
①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3．梯度洗脫
HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。
梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。
在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣，以防止混合時產生氣泡。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到*平衡。
二、進樣器
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。
2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（zui多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用*裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。
六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的zui大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
4．自動進樣。用于大量樣品的常規分析。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。
1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。
2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC-MS聯用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。
3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
② 應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置24小時或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。
四、檢測器
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。
2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。
3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標
1）噪音和漂移：在儀器穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。
4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
幾種檢測器的主要性能：
UV
熒光
安培
質譜
蒸發光散射
信號
吸光度
熒光強度
電流
離子流強度
散射光強
噪音
10-5
10-3
10-9
線性范圍
105
104
105
寬
選擇性
是
是
是
否
否
流速影響
無
無
有
無
溫度影響
小
小
大
小
檢測限(g/ml)
10-10
10-13
10-13
＜10-9g/s
10-9
池體積(µl)
2~10
~7
＜1
——
——
梯度洗脫
適宜
適宜
不宜
適宜
適宜
細管徑柱
難
難
適宜
適宜
適宜
樣品破壞
無
無
無
有
無
5）池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測器(ultraviolet detector)
UV檢測器是HPLC中應用zui廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。
中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率，E為吸收系數。
UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測器有關的故障及其排除
1）流動池內有氣泡
如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀“峰"，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。
2）流動池被污染
無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現故障
紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。
五、數據處理和計算機控制系統
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩沖劑）加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
IV．固定相和流動相
在色譜分析中，如何選擇*的色譜條件以實現分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一。本章著重討論填料基質、化學鍵合固定相和流動相的性質及其選擇。
一、基質（擔體）
HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，zui終使柱效降低。
1．基質的種類
1）硅膠
硅膠是HPLC填料中zui普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。
硅膠的主要性能參數有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；后者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。
2）氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，并顯示出的pH穩定性。
3）聚合物
以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。
所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。
2．基質的選擇
硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
硅膠
氧化鋁
苯乙烯-二乙烯苯
甲基丙烯酸酯
耐有機溶劑
+++
+++
++
++
適用pH范圍
+
++
+++
++
抗膨脹/收縮
+++
+++
+
+
耐壓
+++
+++
++
+
表面化學性質
+++
+
++
+++
效能
+++
++
+
+
注：+++好 ++一般 +差
二、化學鍵合固定相
將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。
1．鍵合相的性質
目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。
殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用*基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的“濕潤"性能。
由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。
pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。
2．鍵合相的種類
化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。
常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。
常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用zui廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。
另外C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。
3．固定相的選擇
分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。
分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
另外，美國藥典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相
1．流動相的性質要求
一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。
選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：
①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。
反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜zui常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優于甲醇-水系統。
在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。
參考資料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價格是甲醇的6~7倍。
反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇
C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。
3．流動相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
4．流動相的脫氣
HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。
離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（系統內）脫氣法無此缺點。zui常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動相的濾過
所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過"）。
用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存
流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
8．HPLC用水
HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。
進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。
I類水標準：
NCCLS
ASTM
電阻率，MΩ·cm，25℃，zui小
10.0
18.0
硅酸鹽，mg/L，zui大
0.05
0.003
微粒，µm濾器
0.22
0.2
微生物，CFU/ml
10
分三檔
美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標準蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。
V．HPLC應用
一、樣品測定
1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議*次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。
2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。
3．記錄時間：*次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。
4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統采用定量環（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）
5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。
6．儀器的使用：
①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。
②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。
③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。
④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。
⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。
⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統，則應更換水）。
二、方法研究
1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如zui靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。
2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。
附件：液相色譜法（HPLC）復核細則
一、對起草單位的要求：
1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。
2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。
3．建立方法時，應考慮下列事項：
①填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。
②流動相甲醇-水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。
③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。
④內標物應易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。
⑤檢測器UV檢測器。
4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。
5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。
二、對復核單位的要求：
1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。
2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行zui低撿出量試驗。
3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。
儀器操作：
- 開機，啟動裝置，進入win2000；開啟LC，點擊Instrumentl online 圖標，進入儀器控制面板，設置所需各項參數。
- 設置分析用流動相清洗流路，等待色譜柱、系統的平衡，基線穩定，開始進樣分析。
- 分析結束，數據處理。
- 關閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關閉脫氣機、泵，關閉整個裝置。
- 關閉總電源，記錄使用情況。
配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣后的對照（含量已標定），打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥。
- 分析結束，數據處理。
- 關閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關閉脫氣機、泵，關閉整個裝置。
- 關閉總電源，記錄使用情況。
配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣后的對照（含量已標定），打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥。