多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美國 Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳研究室Mullis K. B.等人于1985年發(fā)明的一種快速體外DNA片段擴增技術，是八十年代分子生物學資源領域的一項革命性突破，被譽為分子生物學資源發(fā)展*的又一里程碑。該技術一問世，就在分子生物學、醫(yī)學、生物工程、法醫(yī)學、考古學等領域得到快速而廣泛的應用，并且對已建立的基因克隆、DNA序列分析等現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展也起了巨大的推動作用。 
        PCR技術是一種模擬自然DNA復制過程的體外酶促合成特異性核酸片段技術（亦稱無細胞分子克隆技術）。它以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸作為介導，通過DNA聚合酶促反應，在體外進行特異DNA序列擴增。其過程包括模板變性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在內的重復循環(huán)系列，使末端被引物5’端限定的特異性片段成指數(shù)形式累積。由于在每一循環(huán)中合成的引物延伸產物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶DNA的拷貝數(shù)幾乎呈幾何級數(shù)增長。因此20次PCR循環(huán)將產生約一百萬倍（220）的擴增產物，具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強的特點，并且具有從DNA粗制品和降解的 DNA模板中擴增靶序列的能力，這一點在生藥鑒定應用中尤為重要。 
       PCR的原理類似于DNA的天然復制過程，關鍵是運用兩個起始引物，分別為待擴增序列的相對的兩條單鏈DNA結合，結合位點分別位于待擴增序列的兩端，并且3’端相對，然后利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內的復制，在兩個引物之間誘發(fā)聚合酶反應。PCR反應可以簡述如下： 
       在微量離心管中加入適量緩沖液，加微量模板DNA，四種脫氧單核苷酸（dNTP），耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA引物，并有Mg²⁺存在。 
1、加熱使模板DNA在高溫下（95℃左右）變性，雙鏈DNA解開而變成單鏈DNA游離于溶液中。這是所謂變性階段。 
2、PCR的引物是兩段人工合成的寡核苷酸鏈，長度為16－24個核苷酸殘基，其順序由被擴增的DNA片段兩端的序列決定。這兩段寡核苷酸         鏈分別與模板DNA的正鏈和負鏈互補，所互補的位點一個在被擴增序列的“上游”，一個在被擴增序列的“下游”。高溫使模板DNA變性成單         鏈以后，溫度降低，由于PCR反應體系中引物的拷貝數(shù)遠遠多于模板DNA的拷貝數(shù)，因而引物與模板 DNA形成復合物的機率要大大高于          模板DNA兩條單鏈的重新結合。只要嚴格地控制復性的條件，復性過程是傾向于形成引物與模板的復合物的。這是退火階段。 
3、溶液反應溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩          條雙鏈。這是延伸階段。 
         如此重復，改變反應溫度，即高溫變性，低溫退火，中溫延伸三個階段。這三次改變溫度為一個循環(huán)。每循環(huán)一次，使特異區(qū)段基因拷貝數(shù)擴大一倍，一般30次循環(huán)，基因放大數(shù)可達2ⁿ倍。可用公式 
      Y＝（1＋X）ⁿ 
 表示，式中Y＝DNA擴增倍數(shù)，X＝擴增效率，循環(huán)數(shù)為n。 
 如X＝100%，n＝20時，Y＝1048576倍。但實際擴增效率（X）不會達到 100%。 

2 試驗條件 
本程序適用于自動PCR操作，可適用于大多數(shù)情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶等。 
引物（各50pmol） 
0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經反復化凍后會發(fā)生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等） 
模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質粒DNA 
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut） 
10×PCR緩沖液（500mmol/L KCl，15mmol /L MgCl₂，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3） 
礦物油 
電泳所需試劑 

【儀器設備】 
PCR擴增儀 
電泳裝置 
微量離心機 
微量移液器（1～20ml和20～200ml） 
0.5ml Eppendorf 管 
紫外線觀察裝置及照相設備
2.2.2.3 操作程序 
1．在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物：

2．93℃ 反應2 min后開始以下循環(huán)： 
93℃變性反應1 min； 
50℃退火反應1 min； 
72℃延伸反應3 min。 
經過17～35循環(huán)后，zui后一個循環(huán)72℃增加5 min。循環(huán)結束后反應產物置于40℃保存。 
3．取1～5ml反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。

2.2.2.4 應注意的問題及其解決方法 
1．PCR反應條件的優(yōu)化 
要優(yōu)化特定的PCR反應，有必要試用不同的反應組分和循環(huán)參數(shù)。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進反應條件，提高PCR產量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個參數(shù)就行了，如pH值和MgCl₂濃度。表2-2給出了循環(huán)參數(shù)對PCR結果的影響。 
表2-1 PCR各反應組分濃度對產物特異性和產量的影響

* 效果可能不可預測
** 添加10% DMSO時，Taq DNA聚合酶的活性會被抑制47%，因此反應加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產物的特異性和/或產量的循環(huán)參數(shù)

* 使用基因組DNA作模板時，開始幾個循環(huán)變性應于97℃進行 
** 假定Tm值為60℃ 
*** 延伸時間依產物大小而定：1000bp的產物延伸30s即可，產物更長時，按每1000 bp延伸0.5 min計，在后期循環(huán)中增加延伸時間可以提高擴增效率
2．引物的設計 
毫無疑問，引物的堿基組成，長度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經驗，對于某一對引物而言尚無通用的規(guī)則可嚴，但應遵守以下原則： 
（1）一般性原則： 
①長度：15～30bp，其有效長度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否則PCR的zui適延伸溫度會超過Taq酶的*作用溫度（74℃），從而降低產物的特異性。 
②G＋C含量：應在45%～55%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度。引物長度小于20時，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 堿基分布的隨機性：應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現(xiàn)3個的連續(xù)的G或C，否則會使引物在G＋C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 
④ 引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結構。 
⑤引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。 
⑥特異性：與非特異擴增序列的同源性應小于70%，或少于連續(xù)8個的互補堿基。 
（2）引物的3’端： 
引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應，除特殊情況（AS-PCR）外，3’端不應發(fā)生錯配。S. Kwok等發(fā)現(xiàn)，引物的3’端發(fā)生錯配時，A:A使產量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。當末位堿基是T時，即使錯配也能引發(fā)鏈的合成，而為A時錯配的引發(fā)效率zui低，G、C居間。 
因此，引物的3’端堿基選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上的T。 
此外，如果擴增編碼區(qū)域，引物的3’端不要終止于密碼子的第3位，因此處易發(fā)生簡并，從而影響擴增特異性。 
（3）避開引物的二級結構區(qū)： 
某些引物無效的原因是引物重復區(qū)二級結構的影響，因此選擇擴增片段時應注意避開二級結構區(qū)，有些計算機軟件可幫助確定該區(qū)域，如不能避開，則可用7- deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP，有助于PCR成功。 
目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件，從EMBL或Genebank中查找有關基因序列，并依據(jù)上述原則對所選用引物進行評價。 
3．出現(xiàn)異常結果時的解決思路 
在做PCR反應的過程中，由于其酶促反應的本質，影響zui終結果的因素較多，所以出現(xiàn)一些非預料的結果是可以理解的。下面簡單地總結一下在PCR反應結果出現(xiàn)異常時我們應該采取的措施。 
（1）電泳檢查沒有 PCR產物 
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，還需查一下在加樣過程中是否向體系中加過Taq DNA聚合酶； 
b．需檢查一下所使用的引物，看其序列設計是否正確，是否堿基組成不平衡； 
c．需要檢查一下PCR反應過程中模板是否變性充分，尤其在前幾個循環(huán)中是否變性充分；可以適當?shù)靥岣吣０遄冃缘臏囟然蚴沁m當延長變性的時間；  
d．需檢查一下在PCR反應體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑，如SDS污染等等； 
e．需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以預先加熱使之失活。 
（2）電泳檢查出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶 
a．需檢查一下兩個引物的3’端是否互補，或者是否有相類似的回文結構； 
b．需檢查一下使用的引物是否太短，可以予以適當?shù)难娱L； 
c．需檢查模板的用量，模板以10－4個拷貝為*，模板太少會造成引物相對過量； 
d．適當?shù)亟档鸵锏臐舛龋餄舛冗^高是出現(xiàn)引物二聚體的zui主要原因；  
e．循環(huán)次數(shù)太多也易形成引物二聚體，可以適當?shù)販p少循環(huán)數(shù)；  
f．可以將復性溫度提高一些以減少引物二聚體形成。  
（3）電泳檢測PCR產物呈片狀（smear）  
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量，適當?shù)販p少Taq酶的量有助于特異性條帶擴增；  
b．可以提高反應的退火溫度，或者直接采用兩個溫度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板變性）；  
c．適當?shù)亟档蚆g ²⁺ 的濃度也可起到降低非特異性擴增可能性的作用；  
d．適當?shù)販p少反應退火的時間和延伸的時間；  
e．適當?shù)販p少循環(huán)次數(shù)也會有效果；  
f．可以嘗試使用巢式引物PCR（nested primer PCR）。  
（4）電泳檢測PCR產物出現(xiàn)其它非特異性條帶  
a．需檢查一下引物的3’端是否有連續(xù)排列的G或C；  
b．可以適當?shù)靥岣咄嘶饻囟然蛑苯硬捎脙刹綔囟萈CR方法進行擴增；  
c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同時也降低引物的濃度；  
d．可以適當?shù)販p少退火所用的時間以及延伸反應的時間；  
e．可以適當?shù)卦黾踊驕p少一些Mg ²⁺ 濃度。  
4．假陽性  
實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現(xiàn)。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結果，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀器、試劑及任何與擴增產物接觸的東西。  
預防各種污染的措施主要有：（1）工作區(qū)隔離。（2）改進實驗操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。（3）操作程序合理化，如后加陽性對照等。  
交叉污染的處理方法包括：（1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應管內容物以破壞污染的PCR產物。一般選用波長254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）。（2）PCR實驗中使用dUTP，而不用dTTP。在擴增前使用UraciⅠN-glycosylase（尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的PCR產物，而不降解基因組DNA模板，然后熱滅活此酶，再進行擴增反應（Gene, 1990, 93: 125）。美國PE公司提供此類試劑盒（PCR carry-over preventionkit）。（3）在PCR反應前加入一種光化學試劑，反應完成后激活該試劑，光化學試劑可交聯(lián) DNA鏈，使之不能再擴增（Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99）。  
2.2.2.5 PCR技術在分子生藥學中的應用  
對于生藥學家來說，PCR技術已稱為他們研究生藥的一種嶄新而有力的工具。PCR技術在生藥學中的應用主要有兩方面：①擴增和直接測序或者對屬性特異的DNA序列定性以用于系統(tǒng)發(fā)育或親緣關系的分析，也可用于鑒定品種；②通過簡單純化從復雜生物樣品的混合物中鑒定病原體和土壤微生物，用于藥用植物的基因工程。 

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