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Hieff Trans®siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：1179更新時間：2023-02-21 16:23:26
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 一周 | 貨號 | 40806ES01 |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
Hieff Trans®siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑
產(chǎn)品描述
Hieff Trans®siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑是一種非脂質(zhì)體PEI陽離子、兩性分子轉(zhuǎn)染試劑，為siRNA轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中而開發(fā)。適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。這種轉(zhuǎn)染試劑包裹siRNA或miRNA形成陽離子復(fù)合物，該復(fù)合物與細胞表面帶負電的蛋白聚糖相互作用吸附在細胞表面，通過內(nèi)吞進入細胞，形成內(nèi)含體。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用，能夠吸收溶酶體中的H+，質(zhì)子的不斷流入，導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細胞質(zhì)中。
該產(chǎn)品可在廣泛的細胞系中，實現(xiàn)1 nM的siRNA超過90%的表達效率，避免了脫靶效應(yīng)。適用于多種細胞轉(zhuǎn)染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等貼壁細胞；以及難以轉(zhuǎn)染的懸浮細胞系，如K562或THP-1細胞，可達到80%的沉默效率；同時還包括一些原代細胞，原代人成纖維細胞和原代人肝細胞等，可達到80%的沉默效率。
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。產(chǎn)品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷凍！
注意事項
1）整個實驗過程使用無RNA酶和無熱原性的材料，如離心管、槍頭、緩沖液。
2）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理過的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。
3）PEI陽離子轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該在2-8 ℃保存，要注意避免多次反復(fù)長時間開蓋，否則可能會導(dǎo)致PEI揮發(fā)，降低轉(zhuǎn)染效率。
4）轉(zhuǎn)染前一天，確保接種貼壁細胞密度在30%-50%左右，對于一些小細胞和生長緩慢的細胞，接種密度可適當(dāng)擴大2倍。
5）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達不會影響細胞活力。
6）該產(chǎn)品只適合體外轉(zhuǎn)染，不能用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
7）本產(chǎn)品僅作科研用途！
操作流程
一．貼壁細胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和轉(zhuǎn)染1 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請參考表1）
接種貼壁細胞
1.為了提高轉(zhuǎn)染效率，建議在轉(zhuǎn)染前一天接種細胞，接種細胞密度建議30%-50%左右，建議初次使用時設(shè)置梯度進行優(yōu)化最佳使用量。
2.按照以下體系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸轉(zhuǎn)染試劑陽離復(fù)合物：
1）對于每孔細胞，使用100 μL無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混勻。
2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的轉(zhuǎn)染試劑，旋渦10秒，充分混勻。
3）在室溫下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。
【注】：孵育時間不要超過30min
4）在形成復(fù)合物過程中，移除細胞生長培養(yǎng)基，每孔中加入500 μL新鮮預(yù)熱的*全培養(yǎng)基。
5）直接將100 µL siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。最終體積為600 µL ，siRNA終濃度為1 nM。
6）37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至目的基因表達。建議一般mRNA表達水平通常在24-72 h，蛋白表達水平在48-96 h。
圖1 轉(zhuǎn)染貼壁細胞操作流程
【注】：由于靶基因、細胞類型、siRNA效價、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉(zhuǎn)率等因素，均會影響siRNA的轉(zhuǎn)染效率。建議選取siRNA濃度在1 nM到10 nM之間。轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進行調(diào)整，請參見下表1。
表1 siRNA終濃度為1 nM時，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值
培養(yǎng)皿 | siRNA物質(zhì)的量(pmoles) | 每孔siRNA的含量（ng） | siRNA轉(zhuǎn)染試劑體積（µL） | 形成PEI-siRNA復(fù)合物的體積（µL） | *全培養(yǎng)基的體積（含血清+雙抗） | 加入復(fù)合物后，細胞培養(yǎng)基總體積 |
96孔板 | 0.17 | 2.4 | 0.7-0.8 | 50 | 125 µL | 175 µL |
24孔板 | 0.6 | 8.6 | 1-3 | 100 | 500 µL | 600 µL |
12孔板 | 1.2 | 17 | 2-6 | 200 | 1 mL | 1.2 mL |
6孔板 | 2.2 | 31 | 4-12 | 200 | 2 mL | 2.2 mL |
25cm2培養(yǎng)瓶 | 4.4 | 62 | 10-20 | 400 | 4 mL | 4.4 mL |
75cm2培養(yǎng)瓶 | 10.5 | 147 | 30-50 | 500 | 10 mL | 10.5 mL |
表2 siRNA終濃度為10 - 50 nM時，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值
培養(yǎng)皿 | siRNA轉(zhuǎn)染試劑體積（µL） | 形成復(fù)合物的體積（無血清培養(yǎng)基）（µL） | *全培養(yǎng)基的體積（含血清+雙抗） | 加入復(fù)合物后，細胞總體積 |
96孔板 | 0.5-1.5 | 50 | 125 µL | 175 µL |
24孔板 | 2-4 | 100 | 500 µL | 600 µL |
12孔板 | 4-8 | 200 | 1 mL | 1.2 mL |
6孔板 | 8-16 | 200 | 2 mL | 2.2 mL |
25cm2培養(yǎng)瓶 | 15-25 | 400 | 4 mL | 4.4 mL |
二．懸浮細胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和轉(zhuǎn)染5 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請參考表4）
接種細胞
1.為了優(yōu)化懸浮細胞轉(zhuǎn)染條件，與貼壁細胞相比，需要降低懸浮細胞培養(yǎng)基的體積。根據(jù)培養(yǎng)皿大小和完整培養(yǎng)基的體積，推薦接種懸浮細胞的數(shù)量如下表3所示。
表3 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，根據(jù)培養(yǎng)皿的大小，接種懸浮細胞數(shù)量參考值
培養(yǎng)皿 | 底面積(cm2) | 每孔接種細胞懸浮液體積（μL） | 轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種細胞數(shù) |
384孔板 | 0.1 | 25 | 5 ×103~1×104 |
96孔板 | 0.32 | 50 | 1×104~ ×104 |
24孔板 | 2 | 200 | 1×105 ~ 2×105 |
12孔板 | 4.5 | 500 | 2×105 ~ 4×105 |
6孔板 | 9.6 | 1000 | 5×105 ~ 2×106 |
25cm2培養(yǎng)瓶 | 25-28 | 2000 | 2×106~ 5×106 |
2.按照以下體系配制siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物：
1）對于每孔細胞，使用100 μL無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋21 ng siRNA (1.5 pmols)，混勻。
2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的轉(zhuǎn)染試劑，立刻旋渦10秒，充分混勻。
3）在室溫孵育15 min，使得形成siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。
【注】：孵育時間不要超過30 min
4）在每孔200 μL細胞懸浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，輕輕混勻。最終體積為300 µL，siRNA終濃度為5 nM。
5）37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h后，再加入700 µL*全培養(yǎng)基，輕輕搖動培養(yǎng)板使其混勻。
6）繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育，直至目的基因表達。建議一般mRNA表達水平通常在24-72 h，蛋白表達水平在48-96 h。
【注】：為了優(yōu)化內(nèi)源性基因沉默，建議選取siRNA濃度在5 nM到20 nM之間。轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進行調(diào)整，請參見下表4。
表4 siRNA濃度為5 nM時，在懸浮細胞中的參考值
培養(yǎng)皿 | siRNA的濃度(pmoles) | 每孔siRNA的含量（ng） | 轉(zhuǎn)染試劑體積（µL） | 形成復(fù)合物培養(yǎng)基體積（µL） | 懸浮細胞的體積 | 轉(zhuǎn)染4-6h后另加入培養(yǎng)基的體積 |
384孔板 | 0.25 | 3.75 | 1 ± 0.5 | 25 | 25 µL | 0 µL |
96孔板 | 0.5 | 7.5 | 2 ± 1 | 50 | 50 µL | 100 µL |
24孔板 | 1.5 | 21 | 3 ± 2 | 100 | 200 µL | 700 µL |
12孔板 | 3.5 | 49 | 6 ± 4 | 200 | 500 µL | 1 mL |
6孔板 | 6 | 84 | 10 ± 8 | 200 | 1 mL | 2 mL |
25cm2培養(yǎng)瓶 | 12 | 168 | 15 ±10 | 400 | 2 mL | 4 mL |
表5 懸浮細胞中siRNA濃度、轉(zhuǎn)染試劑的用量參考值
培養(yǎng)皿 | siRNA的終濃度/孔（nM） | 轉(zhuǎn)染試劑的體積/孔（µL） |
96孔板 | 1 ~ 20 | 1 ± 0.5 |
24孔板 | 2 ± 1 | |
12孔板 | 3 ± 2 | |
6孔板 | 10 ± 8 | |
96孔板 | 20 ~ 50 | 1.5 ± 0.5 |
24孔板 | 3 ± 1 | |
12孔板 | 5 ± 2 | |
6孔板 | 15 ± 8 |
三．miRNA轉(zhuǎn)染操作流程
該轉(zhuǎn)染試劑也適合轉(zhuǎn)染miRNA，轉(zhuǎn)染貼壁細胞和懸浮細胞的具體操作請參考siRNA的操作流程。
HB220930
