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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 10623ES50 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit RNA合成試劑盒 | 10623ES50 | 50 T | 1782 |
10623ES60 | 100 T | 3382 |
產品描述
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit RNA合成試劑盒進行了轉錄反應體系的優化，試劑盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7 啟動子序列的線型雙鏈DNA為模板，以NTPs為底物，對啟動子下游的DNA序列進行轉錄，高效合成單鏈RNA。轉錄時可在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標記的RNA。
本試劑盒可以合成長轉錄本以及短轉錄本，以1 μg的模板投入量可以產生100-200 μg的RNA，轉錄合成的RNA可用于諸如RNA結構與功能研究、RNA酶保護、探針雜交、RNAi、顯微注射及體外翻譯等多方面的下游應用。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號/規格 | |
10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) | ||
10623-A | T7 RNA Polymerase Mix | 100 μL | 200 μL |
10623-B | 10×Transcription Buffer | 100 μL | 200 μL |
10623-C | ATP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-D | CTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-E | GTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-F | UTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-G | Control DNA Template（500ng/μL） | 10 μL | 20 μL |
產品應用
RNA體外合成
運輸儲存方法
干冰運輸。-20℃保存，有效期兩年。
注意事項
1. 反應體系中須嚴格注意不要混入RNase。
2. 實驗器材（如：槍頭、產品管等）注意嚴格使用 RNase Free用品。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
合成原理
圖1：RNA體外轉錄過程
操作流程
1.DNA模板制備
帶有雙鏈T7啟動子的線性化質?；?/span>PCR擴增產物都可以作為Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit 體外轉錄模板，模板可以用TE緩沖液或Rnase free H2O溶解。
T7啟動子序列： TAATACGACTCACTATAG*GG （注：G*為RNA轉錄的第—個堿基）
A.質粒模板
將目的DNA插入含有T7啟動子的質粒載體中，然后用限制酶進行處理，待*線性化后進行純化。
注：1. 環狀質粒由于沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物，為了得到特定長度的RNA，質粒必須*線性化。
2. 質粒線性化所選限制酶需要在啟動子區域右側、插入DNA///片段的下游，且在插入DNA///片段中無識別位點。選擇的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
3. 為了避免蛋白及鹽離子等對體系的影響，質粒線性化后建議純化后再作為模板進行體外轉錄。
圖2：線性化質粒為模板體外轉錄過程
B.PCR產物模板
帶T7啟動子的PCR產物可以作為體外轉錄模板。首先將T7啟動子序列(TAATACGA CTCACTATAGGG)加在有義鏈的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下擴增含T7啟動子的DNA模板，隨后進行轉錄。PCR產物可以不經純化直接作為模板，但純化后會得到更高的RNA產出。
注：1. PCR產物作為模板，必須電泳確認產物的特異性及濃度，建議20μL反應體系投入2-5μL PCR產物。
2. 為了得到更多高品質的RNA，推薦PCR產物膠回收之后再作為模板進行體外轉錄。
2.RNA體外轉錄
A. 試劑解凍
將T7 RNA Polymerase Mix短暫離心，置于冰上。解凍10×Transcription Buffer和核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP、UTP），混勻并離心至管底，10×Transcription Buffer置于室溫，4種核糖核苷酸置于冰上，備用。
B. 室溫裝配轉錄反應
按下列體系配制反應體系
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
RNase free H2O | Up to 20 | - |
10×Transcription Buffer | 2 | 1× |
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) | 2 each | 10 mM each |
模板DNA | 1 μg | - |
T7 RNA Polymerase Mix | 2 | - |
注： 1. 反應于室溫配置。由于10×Transcription Buffer中含有亞精胺，低溫下亞精胺濃度過高會引起DNA模板沉淀。
2. 短轉錄本（<100nt），模板可使用2ug，轉錄時間增至4-8個小時。
3. 長轉錄本（>1000nt），建議使用質粒線性化模板進行轉錄。
4. 建議在PCR儀中進行反應，熱蓋打開，防止長時間導致反應液蒸發。
5. 反應產物可能有白色沉淀。這是反應過程中游離的焦磷酸與反應液中的鎂離子形成焦磷酸鎂，不影響后續實驗。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影響后續實驗，也可以離心回收上清。
6. 使用試劑、容器等無RNase污染。
C. 37℃孵育2個小時
將上述反應液混合均勻，短暫離心至管底，37℃孵育2個小時。若轉錄本長度小于100nt，增加反應時間至4-8個小時。
D. DNaseⅠ處理（可選）
反應完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
3.產物純化
轉錄后的RNA可以選用RNA Cleaner磁珠進行純化（貨號：12602），也可以采用酚/氯///仿純化法，氯化鋰沉淀法或柱純化等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的RNA經電泳檢測后可進行下游實驗或存儲于-80℃。
A.RNA Cleaner磁珠純化法
提前將RNA clean beads從4 ℃取出，平衡至室溫（約30 min），并用RNase free H2O將轉錄產物稀釋至50μL。
①顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA樣品中（50μL），用移液器吹打6次充分混勻。室溫孵育5 min，使RNA結合到磁珠上。
②將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。
③保持樣品置于磁力架上，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 s，小心移除上清。重復此操作一次。
（注：漂洗時使用的80%乙醇需要使用RNase free H2O新鮮配制，以防止引入RNase酶導致RNA降解。）
④保持樣品始終處于磁力架上，開蓋空氣干燥磁珠5 min。
（注：磁珠開蓋晾干時要避免過分干燥，如果磁珠出現龜裂，則提示磁珠過分干燥，此時RNA的洗脫效率會降低）。
⑤將樣品從磁力架上取出，加入22μL RNase free H2O，用移液器吹打6次以充分混勻，室溫靜置5 min。
⑥將樣品置于磁力架5 min，待溶液澄清后，小心轉移上清20μL至一個新的RNase free PCR管中。
（注：建議轉移上清時留2-3μL液體，以免吸到磁珠影響后續實驗。得到的RNA極不穩定，建議盡快進入下一步。若要保存，請置于-80℃保存。）
B.酚/氯//仿純化法
①向20μL反應混合物中，加入115μL RNase free H2O和l5μL 3M乙酸鈉（pH5.2），混合均勻。
②用等體積的酚/氯///仿（1:1）抽提一次，再用等體積的氯///仿抽提2次，收集上清，并轉移至新的RNase free EP管中。
③加入2倍體積的無水乙醇沉淀RNA。混合均勻后置于-20℃至少30min，以大轉速，4℃離心15min，收集沉淀。
④加入500μL冰預冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀。
B.用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。
C.氯化鋰沉淀法
采用氯化鋰沉淀法，RNA長度要大于300nt，且濃度不能低于100ng/μL。
①向20μL反應混合物中，加入30μL RNase free H2O和30μL7.5M氯化鋰。
②混合均勻后，置于-20℃至少30min，以大轉速，4℃離心15min，收集沉淀。
③加入500μL冰預冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀。
4.用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。
D.柱純化法
純化前加入80μL RNase free H2O將產物稀釋至100μL，再按柱純化說明書進行純化。
4.RNA定量
A.紫外吸收法
游離核苷酸會影響定量的準確性，采用此方法前請先進行RNA純化。然后通過測定產物的A260讀數來確定RNA的產量。對于單鏈RNA，1 A260相當于40µg/mL，所以RNA的產量可以如下計算： A260 x 稀釋倍數 x 40 = µg/mL RNA
B.染料法
用RiboGreen染料進行RNA定量，游離核苷酸不會影響定量，可以對純化或未純化的反應產物中的RNA進行準確定量。
5.RNA大小及質量檢測
A.瓊脂糖電泳法
為了確定RNA的大小，完整度以及質量，需要進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。
B.Agilent 2100 Bioanalyzer檢測法
2100可以用來評估RNA完整度及質量，它僅需要少量的RNA進行分析，高品質的RNA在電圖上應呈現明顯且銳利的峰。
常見問題及解決方案
1.轉錄產物產量低
模板的質量與產量密切相關，實驗組產量明顯低于對照組可能原因有：①實驗模板中有抑制反應成分；②實驗模板本身原因。
建議： ①重新純化模板；②確定模板定量以及其完整性；③延長反應時間；④加大模板投入量；⑤嘗試其它的啟動子和RNA聚合酶。
2.短轉錄本產量低
轉錄起始片段短會抑制反應，轉錄產物小于100nt時，延長反應時間至4-8小時或增加模板量至2ug可以提高RNA產量。
3.RNA轉錄長度大于預期
如果電泳顯示產物條帶大于預期大小，可能原因：①質粒模板可能沒有*線性化；②有義鏈3’端為突出結構；③RNA存在未*變性的二級結構。
建議：①檢查模板是否*線性化，如有必要，額外進行線性化；②選擇合適的限制性酶，避免產生3’突出端，或者用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶補齊后，再進行轉錄；③使用變性膠檢測RNA產物。
4.RNA轉錄長度小于預期
如果電泳顯示產物條帶小于預期大小，可能原因：①模板包含類似于T7 RNA聚合酶的終止序列；②模板中GC含量高。
建議：①降低反應溫度（比如，30℃），有時降低溫度可以增加轉錄長度，但會降低產量。或者嘗試不同的RNA聚合酶進行轉錄；②若模板GC含量高，采用42℃進行轉錄反應，或者添加SSB提高產量及轉錄長度。
5.轉錄產物電泳拖尾
電泳過程中有拖尾現象，可能原因：①實驗操作過程被RNase污染；②DNA模板被RNase污染。
建議：①實驗過程中使用RNase-free的槍頭和EP管，佩戴一次性乳膠手套和口///罩，所有試劑均用RNase free H2O配制。②重新純化模板DNA。
HB200916
