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Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry) 

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測試劑盒（流式分析）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP），又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mPTP)可能參與了細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。

正常的細(xì)胞線粒體內(nèi)膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細(xì)胞呼吸作用及能量供應(yīng)，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開和閉合中來回切換。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時和病理性死亡時，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測試劑盒（流式分析）檢測方法是一種相對于僅基于線粒體膜電位分析更直接的檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的檢測方法。其原理是：首先通過被動運輸加載Calcein AM，后者是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線粒體發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。加入CoCl2后，來自胞質(zhì)的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內(nèi)的熒光。作為對照，可將細(xì)胞加載Calcein AM和CoCl2的同時，對其用離子霉素處理，從而使細(xì)胞加載更多的Ca2+，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活從而使線粒體熒光淬滅。

本試劑盒以1ml標(biāo)記體系計算，可供100次檢測。檢測zui大激發(fā)波長494nm，zui大發(fā)射波長517nm。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融，有效期至少6個月。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

為了達(dá)到*實驗效果，需針對不同的細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件等進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。本品還可配套其他探針一起操作。

1、 1mM Calcein AM儲存液制備

取出試劑并回溫至室溫，吸取50µl DMSO溶解1管Calcein AM，混勻后避光保存。

【注】：鈣黃綠素一旦溶解后，建議設(shè)置一系列實驗將其短時間內(nèi)用完，不能長期保存鈣黃綠素溶液。

2、 細(xì)胞染色（流式分析）

1）用本試劑盒含有的Cell Stain Buffer將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，使其密度為1×106細(xì)胞/ml。

【注】：① 用于離子霉素對照樣品的緩沖液必須含有Ca2+；

       ② 鈣黃綠素加載時不能含有血清；

       ③ 細(xì)胞必須為單細(xì)胞懸液。

2）按照1ml每管將細(xì)胞懸液等分，每個樣品等分成3份。

后續(xù)染色順序：1號管僅含鈣黃綠素，2號管含鈣黃綠素和CoCl2，3號管含鈣黃綠素，CoCl2和離子霉素，另外準(zhǔn)備一管不含試劑的細(xì)胞樣品用于相應(yīng)的儀器設(shè)置。

3）用Cell Stain Buffer 1:500稀釋1mM Calcein AM儲存液，制備成2µM的工作液，例如取5µl 1mM儲存液加入2.5ml Cell Stain Buffer，混勻即可。

4）向上述每個樣品的3管中分別加入5µl Calcein AM工作液并混勻。

5）向2號、3號管中加入5µl CoCl2，并混勻。

6）向3號管中加入5µl Ionomycin(100µM)，并混勻。

7）在37℃避光孵育15min。

8）向每管中加入3.5ml Cell Stain Buffer，離心收集細(xì)胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起熒光淬滅的試劑。

9）用400µl同時可用于流式檢測的合適的緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)。

如果需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色。如用標(biāo)記的Annexin V 檢測磷酯酰絲氨酸易位；用PI 檢測細(xì)胞活力；或者用MitoTracker紅色探針檢測線粒體活力等。注意整個過程均需避光操作。

10）染色后，將樣品置于冰上，1h內(nèi)進(jìn)行流式分析。

11）用不含試劑的細(xì)胞樣品進(jìn)行相應(yīng)的儀器設(shè)置。用流式488激發(fā)器進(jìn)行熒光分析，Calcein AMzui大激發(fā)波長494nm，zui大發(fā)射波長517nm。

1號管-僅含鈣黃綠素：線粒體和胞漿有熒光，熒光信號較強(qiáng)；

2號管-含鈣黃綠素和CoCl2：僅線粒體呈現(xiàn)熒光，熒光強(qiáng)度居中；

3號管-含鈣黃綠素，CoCl2和離子霉素：線粒體和胞漿熒光均被淬滅，熒光信號zui弱。

2號管和3號管熒光信號的變化說明線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被不斷的激活。

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