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Alkaline Phosphatase Activity Detection Kit 堿性磷酸酶活性檢測試劑盒

產品信息

產品描述

堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，簡寫為ALP或AKP），又稱堿性磷酸酯酶，是一組同工酶，目前已發現六種ALP1-ALP6。廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織，是經肝臟向膽外排出的一種酶。堿性條件下可催化磷酸酯鍵的水解，從而將底物分子上的磷酸基團去除，轉化為羥基。此類底物包括核酸（DNA、RNA）、蛋白、生物堿等。常見的有腸道堿性磷酸酶、非組織特異性堿性磷酸酶、胎盤堿性磷酸酶等；生物學中堿性磷酸酶（ALP）水平的變化及其活性的高低常被作為一種檢測組織行為的指標，如：1）作為iPS成功誘導的標志；ALP在大多數細胞類型中均有表達，但是在iPS細胞內的表達水平明顯升高；2）結腸癌細胞分化程度定性和定量的指標；3）血清中堿性磷酸酯酶的升高可導致高堿性磷酸酶血癥，常被認為和惡性膽管阻塞，原發性硬化膽管炎，肝癌，肝硬化等肝膽疾病密切相關；4）血清中堿性磷酸酶活性升高還和骨骼損傷導致的骨生成，以及骨骼疾病如纖維骨炎、佝僂病、成骨不全等密切相關；5）堿性磷酸酶水平也會出現一些病理性降低的情況，多見于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機能不全、貧血等。對于正常成人來說，血清內ALP的范圍為40-150U/L。 

對硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate, pNPP）是一種常用的磷酸酶顯色底物，堿性條件下，可在ALP作用下生成對硝基苯酚（p-nitrophenol, pNP），后者在堿性環境下呈黃色產物，并在405nm處可檢測到zui大吸收峰。產物黃色越深，說明ALP活性越高，反之則活性越低。因此，通過檢測OD405吸光值即可計算ALP活性水平。

本品為堿性磷酸酶活性檢測試劑盒，可快速、便捷地檢測細胞或組織裂解液/勻漿液、血清、血漿、尿液、純化酶等樣品中的ALP活性。該試劑盒包括標準品和空白對照，可進行達100個樣品的檢測。

產品組分

保存條件

冰袋運輸。-20℃保存，一年有效。其中顯色底物、pNP標準溶液需要避光保存。

注意事項

1）如果進行酶活力的定量，進行酶反應時必須注意精確計時。此時推薦孵育30min等較長時間，以減小操作過程中的時間誤差。如果樣品中酶活性較高，則可以預先適當稀釋樣品。

2）樣品溶液中須避免出現EDTA、氟離子、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶抑制劑。

3）ALP反應緩沖液和p-nitrophenol標準品溶液對人體有害，請注意適當防護。反應終止液有腐蝕性，請小心操作。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明

• 試劑準備

將所有試劑取出，恢復至室溫使用。

1）顯色底物溶液：取一管顯色底物，溶解于2.5ml的ALP反應緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上放置。【注】：新鮮配制的顯色底物溶液需在數小時（≤ 6h）內使用。

2）標準品工作液：取10μl p-nitrophenol標準品溶液(10mM)，用ALP反應緩沖液稀釋至0.2ml，使得終濃度為0.5mM。

2．樣品準備

1）細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞和組織，如果有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于ALP活性的檢測。【注】：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。樣品可以-80℃凍存，避免反復凍融。

2）血漿、血清和尿液的準備：血漿和血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設置加了血漿或血清但不加底物的對照。【注】：血漿制備不能用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管。尿液通常也可以直接用于測定。上述樣品可以-80℃凍存，避免反復凍融。

3）樣品的稀釋：若樣品中含有較高活性的ALP，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以采用試劑盒中的ALP反應緩沖液進行稀釋。若使用上述反應緩沖液進行稀釋，需保留足夠的緩沖液用于試劑盒的檢測過程。

3．加樣

參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。標準品的用量分別為4、8、16、24、32和 40μl，樣品通常可以直接加50μl。如果樣品中的堿性磷酸酶活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。

表1 各組分加樣數據表

4. 混勻：用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻。
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（待測樣品中ALP活性較低時，可適當延長孵育時間至30min）

6. 終止：每孔加入100μl反應終止液終止反應。此時，標準品或有ALP活性的孔會呈現不同深淺的黃色。

7. 檢測：405nm測定吸光度。如果不能測定405nm，也可以在400-415nm范圍內檢測吸光度。如果不能立即測定，可以在數小時內完成測定，所顯現的黃色在數小時（≤ 6h）內穩定。

8. 結果分析

堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的二乙醇胺（diethanolamine, DEA）緩沖液中，37℃條件下，每分鐘水解pNPP顯色底物產生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸緩沖液中，25℃條件下，每分鐘水解pNPP顯色底物產生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個甘氨酸酶活力單位。一個甘氨酸酶活力單位約相當于3個DEA酶活力單位。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。

zui后，根據酶活性單位的定義，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。