通過將特定 J 聚集染料的 DMSO 溶液然后通過離心純化來制備大量 J 聚集體。將所得的 J 聚集體重新分散在 HEPES 緩沖液中，用于光學(xué)研究。染料和J-聚集體的光學(xué)特性如圖2a所示。以化合物 9 為例，比較了單體和 J-聚集體的光學(xué)性質(zhì)（圖 2a–2c）。如圖 2a 所示，化合物 9（單體）具有相對較寬的吸收帶，最長為 878 nm，而其 J 聚集體 （CYJ1007） 在1007 nm 處表現(xiàn)出尖銳、紅移和強(qiáng)烈的吸收帶，以及幾乎重疊的熒光帶。此外，CYJ1007顯示出強(qiáng)烈的丁達(dá)爾效應(yīng)，這是粒子形成的標(biāo)志。如在TEM上觀察到的那樣，顆粒呈現(xiàn)出球形形態(tài)。如圖 2b 所示，J 聚集體的熒光壽命比單體短得多，為 J 聚集體的形成提供了額外的證據(jù)。此外，圓二色性（CD）光譜（圖2c）顯示，單體在600 nm至1200 nm范圍內(nèi)不表現(xiàn)出CD信號，而J聚集體CJY1007在CYJ1007的吸收（1007 nm）處顯示出具有強(qiáng)烈、尖銳和負(fù)峰的CD信號，這可能是由J聚集體中的手性排列、激子耦合和/或長程有序引起的。

聚集體的形成相當(dāng)快，如將化合物9的DMSO溶液加入HEPES后10分鐘內(nèi)吸光度突然增加所證明的那樣（圖2d）。化合物9在30nM至50nM之間的HEPES溶液中也表現(xiàn)出低臨界聚集濃度，同時在生物體液中具有很強(qiáng)的J聚集傾向。有趣的是，一些單體的吸收光譜幾乎相互重疊（圖2e），而其J聚集體的吸收光譜各不相同，范圍從1007 nm到1059 nm（圖2f）。J聚集體在生理pH值下還表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膒H穩(wěn)定性，比單體具有更好的光穩(wěn)定性，并且在37°C下在FBS中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。為了追求這些 J 聚集體在水性介質(zhì)中的更大穩(wěn)定性，這對于體內(nèi)光學(xué)成像至關(guān)重要，研究者將 J 聚集體封裝在 Pluronic F127 膠束中。值得注意的是，這種封裝僅引起其吸收光譜的微小變化，同時大大提高了它們的穩(wěn)定性。HEPES中封裝的J聚集體比商業(yè)和報道的NIR-II分子染料和水性介質(zhì)中的J-聚集體具有更窄的光譜帶。

從化合物 10 和 14 開始分析，這兩種化合物都不能形成 J 聚集體。化合物10采用“人字形”堆疊（圖3a），相鄰堆疊在相反方向上“俯仰”和“滾動”，其相鄰分子在堆棧內(nèi)表現(xiàn)出較大的橫向位移（3.57 ?）（圖3a4），因此它們之間的π-π相互作用可以忽略不計。對于化合物14，其末端基團(tuán)高度扭曲和彎曲，兩個苯并吲哚平面之間具有較大的二面角（圖3b）。在14中，苯環(huán)直接連接到三氟乙胺基團(tuán)導(dǎo)致較大的空間位阻，使14成為“擁擠”的菁并抵消J聚集。顯然，10 和 14 的單晶中的堆積排列不利于 J 聚集。

化合物8、15、11、9、24和19在單晶中都表現(xiàn)出磚層堆積，其分子堆積排列的特點是縱向位移大，橫向位移小，有利于J聚集體的形成（圖3c-3e）。然而，觀察到化合物 8 和 15 盡管它們在分子結(jié)構(gòu)上與 9 高度相似（8 在介觀取代基處的乙酰基與三氟乙酰基，以及 15 在吲哚氮處的甲基與乙基），但未能形成 J 聚集體，而其他四種 （9、11、24 和 19） 可以。單晶是通過非常緩慢的溶劑擴(kuò)散過程生長的，該過程更像是熱力學(xué)上有利的過程。六種染料在單晶內(nèi)的分子排列表明它們可能具有形成J 聚集體的傾向。然而，與單晶相比，水介質(zhì)中J聚集體的形成更復(fù)雜、更迅速，動力學(xué)因素成為J聚集體形成的關(guān)鍵決定因素。8 中介消旋取代基上的乙酰基和 15 中吲哚氮上的甲基與 9 中的對應(yīng)物相比尺寸相對較小。這可能導(dǎo)致 8 和 15 的分子振蕩增加，尤其是當(dāng)放置在水性介質(zhì)中時，從而降低它們的 J 聚集能力。關(guān)于9、24和19形成的三種單晶，它們都可以形成J聚集體，并且其結(jié)構(gòu)中具有苯吲哚末端基團(tuán)，觀察到它們的層間縱向位移（18.70、19.57和19.95 ?）與相應(yīng)的J聚集體表現(xiàn)出的吸收量（1007、1045和1059）之間存在正相關(guān)關(guān)系。

這些結(jié)果表明，單晶內(nèi)的堆積排列與J聚集之間存在有意義的相關(guān)性，這意味著理解單晶內(nèi)的分子堆積可能是評估染料J聚集傾向的寶貴方法。控制單晶內(nèi)分子堆積的各種力和空間位阻因素也可以在J聚集染料的設(shè)計中得到利用。

圖5.  1@β-LG （50 μM）、CYJ981@F127 （50 μM） 或 CYJ1059@F127 （50 μM） 注射三組染料三色MSOT成像

三色多光譜光聲斷層掃描 （MSOT） 成像是通過將三種染料注入小鼠體內(nèi)并在單次運行中用多個 （13） 個波長照亮每個樣品（圖 5a）進(jìn)行的，然后進(jìn)行超聲檢測、重建和光譜分離。為了評估在多路 MSOT 成像框架內(nèi)三種染料之間的潛在串?dāng)_，進(jìn)行了一項評估，涉及皮下注射三種單獨的染料或三個染料組（標(biāo)記為 I、II 和 III 組，每組包含兩種不同的染料，如圖 5b 所示）到小鼠中。這些注射劑在小鼠的三個不同部位小心地進(jìn)行，分別位于背部、左腰部和右腰部。評估結(jié)果（圖5c和S62）表明，在這兩種實驗場景中都不存在串?dāng)_。作為一個說明性的例子，當(dāng)將1@B-LG施用于小鼠的左腰（I組）和右腰（III組）時，從1@B-LG（左上圖）發(fā)出的MSOT信號精確地定位在左腰部和右腰部，確認(rèn)成像中沒有串?dāng)_（圖5c）。

隨后，進(jìn)行三色MSOT成像，以闡明三種染料給藥后的生物分布，成像過程的時間線如圖5d所示。將個體小鼠輕輕麻醉并小心地放置在成像室中進(jìn)行MSOT成像，其持續(xù)時間為-6分鐘至62分鐘。在0 min和10 min時，分別通過尾靜脈將CYJ981@F127和1@β-LG注射到小鼠胃中，而在20 min時通過管飼管將CYJ1059@F127遞送至小鼠胃底部。通過掃描小鼠腹部區(qū)域的特定部分獲得一堆橫截面（2D）MSOT圖像，這些橫截面圖像可以單獨檢查或渲染成3D表示（強(qiáng)度投影，MIP）。圖5e顯示了小鼠的冷凍切片圖像，其橫截面位置與圖5f中的橫截面位置相對應(yīng)。通過記錄每種染料的信號，可以監(jiān)測三種染料的生物分布，如單通道和復(fù)合圖像所示（圖5f）。顯而易見的是，1@β-LG選擇性地在兩個腎臟內(nèi)積累，而CYJ981@F127和CYJ1059@F127分別位于肝臟和腸道中。兩個感興趣區(qū)域的三色MSOT成像進(jìn)一步證實了這一觀察結(jié)果。此外，圖5g中的3D MSOT圖像提供了與三種染料分布相關(guān)的空間信息，使研究者能夠更精確地定位染料的生物分布。離體三色成像為三色MSOT成像提供了額外的證據(jù)。重要的是，染料的低細(xì)胞毒性和體內(nèi)毒性分別通過細(xì)胞毒性研究和主要解剖器官切片的蘇木精和伊紅（H&E）染色得到驗證。

這項研究揭示了一種有前景的解決方案，通過在七亞甲基菁的介觀位置引入包含三氟乙酰基單元和芐基單元的龐大支鏈結(jié)構(gòu)，確保J聚集體在NIR-II區(qū)域的吸收帶。通過對N-芐基部分的微小修飾，已經(jīng)獲得了一系列具有不同光譜性質(zhì)的J聚集體。已經(jīng)成功生長了九種單晶，對這些晶體學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，這表明，當(dāng)染料的單晶結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與J聚集一致的特征時，它可能具有形成J聚集體的內(nèi)在趨勢。此外，一系列 J 聚集體的可用性，其特點是具有有利的光譜特性，包括紅移和窄吸收/發(fā)射光譜以及增強(qiáng)的消光系數(shù)，能夠構(gòu)建用于多路復(fù)用三色 NIR-II 熒光和 MSOT 成像的染料組合，在無串?dāng)_的成像中實現(xiàn)顯著的時空精度。這項研究為生成具有所需光譜特性的J聚集體提供了一種有效且直接的方法。

參考文獻(xiàn)

Zhang C, Wu Y, Zeng F, et al. Structurally Modulated Formation of Cyanine J‐Aggregates with Sharp and Tunable Spectra for Multiplexed Optoacoustic and Fluorescence Bioimaging[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(34): e202406694.