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禽流感病毒檢測技術的研究新進展

2013-4-4　　閱讀(1362)

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禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和／或疾病綜合癥。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，典型病毒粒子為球形，直徑８０～１２０ｎｍ，有時呈絲狀體等形態。至今已發現Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６種，神經氨酸酶（ＮＡ）有９種（傅生芳，２００５），根據表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差異可以分為１６個ＨＡ亞型和９個ＮＡ亞型，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發生基因重排，出現具有新的生物學特征的病毒，因此，ＡＩＶ zui顯著的生物學特征之一就是亞型眾多。而且，不同亞型或血清型之間無交叉反應性或反應性低，這使得禽流感的診斷監測工作較為困難。禽流感根據ＡＩＶ致病力的強弱可分為高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ），前者不僅可以引起家禽死亡，還可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的發生和流行具有重要意義。文章就禽流感近幾年的研究，尤其是在病原學檢測、免疫分

析方法和分子生物學檢測方法的研究進行了綜述。

１　病原學檢測

１．１　病毒的分離鑒定
ＡＩＶ在雞胚中生長良好，將疑似病料經適當處理接種在９～１０日齡的雞胚中，分離培養病毒。若檢測出有凝血活性，可進一步確定分型；若無凝血活性，則認為未分離到病毒（趙翠燕等，２００３），該方法具有、敏感的優點，但操作繁瑣，耗時較長，需要１周左右的時間。

１．２　電鏡技術　
利用電鏡技術可以直觀準確地鑒別病毒，根據病毒自身的形態、結構等不同特征，能很快做出診斷。檢驗結果與樣品制備技術、收取病料的部位和時間有關，電鏡法不能用于亞型及致病性的測定且其受到設備的限制，投入資金較大（劉志杰等，２０１１）

２　免疫分析技術

２．１　免疫傳感技術　
隨著生物傳感器的飛速發展，出現了生物傳感器微陣列、微系統，該技術靈敏度高、響應快，不需要標記，既可定性又可定量，克服了傳統檢測方法費時、昂貴、標記及操作繁瑣等缺點，具有極廣泛的發展前景及臨床使用價值，成為生物傳感器領域的研究熱點（姚春艷等，２００６）。免疫識別膜的固定化技術是生物傳感器制作的核心部分，其固定化技術決定著生物傳感器的選擇性、靈敏度、穩定性和壽命等主要性能，也決定著生物傳感器是否有研究和應用價值。詹愛軍等（２００９）將石英晶片諧振的高靈敏度與免疫反應的特異性相結合，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在鍍金膜的石英晶體電極偶聯抗Ｈ９亞型流感病毒的單抗構建傳感器探頭形成免疫傳感器。檢測結果表明，該方法具有較好的特異性，不與Ｈ５亞型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反應，檢測靈敏度達到２０ＥＩＤ５０，組成的檢測器對相應的流感病毒響應良好，該法與雞胚病毒分離法檢出流感病毒的符合率達到９１％。林向華等（２００９）以ＡＴ切型、基頻１０ＭＨｚ的石英晶體為材料，設計四通道芯片微陣列。采用聚乙烯亞胺黏附—戊二醛交聯法

將禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型單克隆抗體固定在石英晶體的金膜電極表面制備生物敏感膜，構建可用于同步檢測禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型的壓電免疫芯片。構建的壓電免疫芯片用于檢測Ｈ５、Ｈ９亞型抗原和疑似樣品，其各自的響應值與空白對照的噪聲值之比均大于２，試驗構建的壓電免疫芯片可用于禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型的定性檢測。

２．２　蛋白質芯片技術　
蛋白質芯片技術是一種高通量、高靈敏度、自動化的蛋白質分析技術，在蛋白質組的功能研究、疾病診斷及藥物開發中顯示出巨

大的應用潛力（Ｓａｎｇ等，２００８）。石霖等（２００９）制備了可以同時鑒別診斷禽流感（ＡＩ）、新城疫（ＮＤ）２種

禽病血清抗體的可視化蛋白質芯片，將芯片與待檢血清雜交后，再與膠體金標記的二抗雜交，銀染顯色后根據灰度值判定結果，該可視化蛋白質芯片具有很好的特異性，?Z?X暅并且檢測靈敏度是瓊脂糖凝膠擴散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上。研究結果表明，該方法可用于同步鑒別兩種禽病，是一種有效的抗體檢測新方法。該技術不僅保留了抗原—抗體反應快速、靈敏和特異性的特點，還可以滿足生物樣本多指標分析的需要，因此更利于大規模推廣應用（Ｓｍｉｔｈ等，２００６）。

２．３　膠體金免疫層析法　
陳洪等（２００７）用膠體金顆粒標記Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ｂ（３Ｃ４）噴涂于硝酸纖維膜質控線和檢測線上，研制出Ｈ５亞型禽流感病毒抗原金標快速診斷試紙條。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９標準抗原和新城疫標準抗原作為檢測抗原對研制的試紙條進行特異性、敏感性和穩定性試驗，試驗結果表明該方法操作簡單、靈敏度高、特異性強、穩定性好，具有良好的應用前景。單抗介導的斑點免疫金滲濾法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感單克隆抗體和膠體金標記技術建立的快速檢測ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ診斷方法，２０～３０ｍｉｎ即可出結果，ＤＩＧＦＡ具有不需試驗設備、可用肉眼判定、方法簡便、試劑用量少、對人體無害等優點（雷彩俠，２００７）。

２．４　熒光抗體試驗
免疫熒光技術（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被標記上熒光色素的抗原（或抗體）特異性地與抗體（或抗原）結合，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應來進行觀察的檢測方法。zui早用于鑒定ＡＩＶ的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年開始用于人類流感的快速診斷。秦愛建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亞型病毒的單克隆抗體，建立了免疫熒光方法檢測ＡＩＶ，可以檢測出相應的Ｈ５亞型病毒。建立在單克隆抗體基礎上的免疫熒光方法具有快速、簡便、易行、較敏感等特點，也常用于臨床診斷，但出現假陽性的幾率較高。

２．５　單克隆抗體技術　
李娜等（２００７）利用禽流感Ｈ９亞型病毒（ＡＩＶ－Ｈ９）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得了５株特異性抗ＡＩＶ核蛋白的單克隆抗體細胞株。這５株單克隆抗體能與所有試驗的ＡＩＶ－Ｈ９病毒反應，Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法鑒定結果表明，單克隆抗體僅識別６０ｋｕ的蛋白抗原，而不與新城疫病毒、禽網狀內皮組織增殖癥病毒、傳染性法氏囊病毒等反應。初步應用結果顯示，以這些單克隆抗體建立的間接免疫熒光試驗或ＥＬＩＳＡ方法可迅速檢測出禽流感病毒，這些單克隆抗體在禽流感的預防監測中將發揮重要的作用。

２．６　酶聯免疫吸附試驗技術
酶聯免疫吸附試驗技術（ＥＬＩＳＡ）創立于１９７１年，１９７４年Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等首先用ＥＬＩＳＡ對注射流感病毒所產生的抗體消長規律進行了檢測。ＥＬＩＳＡ具有較高的敏感性，既可以檢測抗體，又可以檢測抗原，且結果易于分析，在流感的控制、撲滅和檢疫中用途很大。Ｗｕ等（２００７）運用表達的核蛋白（ＮＰ）建立了禽流感抗體定量間接ＥＬＩＳＡ檢測技術。目前，國內外已經有成熟的禽流感抗原抗體檢測試劑盒出售，在ＡＩＶ流行病學普查及早期診斷上起到了重要的作用。李海燕

等（１９９９）在禽流感全病毒酶聯免疫吸附試驗（ＥＬＩＳＡ）和斑點ＥＬＩＳＡ研究的基礎上，建立了以桿狀病毒系統表達的ＡＩＶ核蛋白為抗原的禽流感間接酶聯免疫吸附試驗診斷技術（ＲＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。此法不僅具有與ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ同樣的特異性和敏感性，而且具備了抗原制備工藝簡單、生物安全度高、成本價廉、易于生產等優點。

２．７　瓊脂凝膠擴散試驗　
瓊脂凝膠擴散試驗（ａｇａｒｇｅｌｉｍｍｕｎｏｄｆｆｕｏｎ，ＡＧＩＤ）是一種定性的檢測方法，操作簡便，不需要特殊設備，且有較好的特異性和檢出率。唐松元等（２００７）采用ＡＧＰ檢測雉類患疑似禽流感病１８例，陽性檢出率１００％，用ＨＡ、ＨＩ驗證試驗符合率為１００％，從而建立一種簡易、快速、準確的診斷方法，為快速檢測本病提供可靠依據。

２．８　乳膠凝集試驗
乳膠凝集試驗（ＬＡＴ）主要用來檢測ＩｇＭ抗體，其特點敏感性不如經典的ＨＩ試驗，但由于不需要較高的試驗技術和特定的儀器設備，簡單、快速，可方便地用于臨床診斷和生產實踐。喻正軍等（２００５）以羧化的聚苯乙烯乳膠為載體，采用了共價偶聯的技術，經雙功能試劑將ＡＩＶ的ＨＡ抗原表達產物和羧基化的乳膠共價偶聯起來，對血清中特異性ＨＡ抗體進行檢測，克服了蛋白質致敏普通乳膠時，致敏抗原量少、不穩定，致敏抗原上的蛋白質容易脫落等缺點。此外，血凝及血凝抑制試驗（ＨＡ，ＨＩ）簡單、快速、特異性好，但敏感性較差，主要用于ＡＩＶ亞型鑒定和病毒分離鑒定的輔助手段，不能直接檢測組織液和分泌液中的病毒，并且需要排除新城疫病毒、腺病毒等的干擾，且不能檢出病毒新的ＨＡ亞型。神經氨酸酶抑制試驗（ＮＩＴ）主要用于ＡＩＶ的表面抗原神經氨酸酶的亞型鑒定，雖不能提供常量法的定量，但卻是Ａ型流感病毒的分類和抗體檢測的快捷方法，被世界衛生組織推薦用于ＮＡ亞型的分類（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，２００８fs19 ）。ＮＩＴ成本較低且有可重復性，但試驗繁瑣，不易掌握，易受病毒ＨＡ抗體的干擾（任麗偉等，２００９）。病毒中和試驗（ＮＴ）是zui敏感且特異的血清學方法，檢出率也相當高，雖然它的操作繁瑣且耗時，但它高度的特異性是*的，很多新的檢測方法都要以之為標準來進行比較（楊帆，２００７）。

３　分子生物學技術

３．１　ＲＴ－ＰＣＲ技術　
ＲＴ－ＰＣＲ技術從基因水平檢測ＡＩＶ　ＲＮＡ基因，具有高度敏感性和特異性，大大縮短了對ＡＩＶ的檢出時間。１９８６年，Ｐｅｒｄｕｅ用聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）診斷禽流感，從接種雞胚到獲得結果僅需６ｈ，大大縮短了禽流感的診斷時間（廉

慧鋒等，２００４）。國內學者陳思懷等（２００６）針對ＮＰ（型診斷）、ＨＡ（亞型診斷）基因設計２對引物，從而

對Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９亞型ＡＩＶ做快速檢測。馬鳴瀟等（２００５）針對Ｈ５和Ｈ９兩個亞型，各設計一套特異性的引物，建立了ＲＴ－ＰＣＲ一步法，用于Ｈ５和Ｈ９亞型的鑒別。謝芝勛等成功建立了快速檢測鑒別ＡＩＶ　Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亞型的多重ＲＴ－ＰＣＲ方法，對ＡＩＶ不同亞型ＲＮＡ的zui低檢測量為１０ｐｇ，不需要對病原體進行分離增殖就可對臨床疑似ＡＩＶ感染

的樣品或環境樣品進行直接檢測和鑒別，避免了進行ＡＩＶ分離增殖過程中散毒和傳播等風險（龐耀珊等，２００５；Ｃｈｅｎ等，２００８）。

３．２　生物傳感技術　
傳感器在流感上的應用zui初見于２０世紀９０年代，生物傳感器技術的發展能迅速和具體診斷本病，使臨床工作者能迅速確定是否

治療（Ａｍａｎｏ等，２００５）。時偉杰等（２００９）將Ｇ４ＰＡＭＡＭ固定在玻碳電極表面，然后通過共價作用固定禽流感病毒探針ｓｓＤＮＡ－１，以［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋為指示劑，采用示差脈沖伏安法和交流阻抗法對ＤＮＡ電化學生物傳感器進行了表征。研究結果發現，通過與雙鏈ｄｓＤＮＡ作用的［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋的峰電流信號的變化，可以識別和定量檢測溶液中互補的禽流感病毒ＤＮＡ片段。經過條件優化，該法測定ＤＮＡ的濃度線性范圍為１．３×１０－９～６．５×１０－８ｍｏｌ／Ｌ，zui低檢測限為９．２×１０－１０　ｍｏｌ／Ｌ。

３．３　基因芯片分型技術　
芯片技術是融生物學、物理學、化學、計算機科學和微電子學一體的高度交叉的新技術。將大量的核酸分子以大規模陣列形式排

布在很小的載玻片等載體上，通過與標記的樣品進行雜交，檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中被檢分子的數量。曹三杰等（２００６）制備的ＮＤＶ－ＩＢＶＡＩＶ－ＩＢＤＶ診斷基因芯片質量好，可對ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ和ＩＢＤＶ進行診斷檢測，具有檢測靈敏性好，特異性高和芯片可重復檢測的優點。試驗對３０個臨床樣品進行初步應用檢測，結果表明該診斷基因芯片技術與ＲＴ－ＰＣＲ檢測技術檢出率基本一致，并具有同步診斷檢測多種疫病的優點。Ｘｕｅ等（２００８）通過設計ＡＩＶ　２５個特異性引物和１個通用引物，經ＲＴ－ＰＣＲ或重疊ＰＣＲ擴增了這２５個亞型的ｃＤＮＡ，研制出了一種能檢測禽流感１６個ＨＡ和９個ＮＡ的ＤＮＡ芯片。由于基因芯片技術特異、敏感且允許同時掃描成百上千的核苷酸序列，已成為一種具有巨大潛能的禽流感診斷方法。上已經有關于基因芯片技術在流感亞型鑒別上應用的報道，直接檢測流感病毒的ｃＤＮＡ技術將作為流感病

毒亞型鑒別的一種新途徑（王秀榮等，２００５）。

３．４　核酸依賴的擴增　
核酸依賴的擴增（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＮＡＳＢＡ）是一種連續、等溫、基于恒溫反應的核酸擴增技術。該技術使用３種（禽類成肌細胞增多癥病毒反轉錄、核糖核酸Ｈ、噬菌體Ｔ７核糖核酸聚合酶）和２種特別設計的寡核酸引物。上游引物５′末端包含有噬菌體Ｔ７的依賴于ＤＮＡ的ＲＮＡ聚合的啟動子序列，下游引物的５′末端包含有和釕標電化學發光檢測探針（ＥＣＬ　Ｐｒｏｂｅ）互補的序列。在擴增步驟中，兩個５′端都整合進擴增序列中，從而率生產出互補ＲＮＡ序列的模板。該技術特點是整個擴增過程在恒溫條件下進行，不受背景中ＤＮＡ的干擾，不易發生交叉污染，擴增效率高于ＰＣＲ，特異性好，不需要特殊（如ＰＣＲ儀）的控溫裝置，檢測禽流感群特異性毒株（Ｈ１、Ｈ１５）（ＮＡＳＢＡ－ＡＩＶ）、Ｈ５亞型（ＮＡＳＢＡＨ５）、Ｈ７亞型（ＮＡＳＢＡ－Ｈ７）的ＮＡＳＢＡ／ＥＣＬ檢測

試劑盒，與現行的病毒培養檢測方法的靈敏度相當，可以同時檢測５０個樣本，進行大規模檢樣（劉樂庭，２００５）。目前已標準化的有《Ｈ５亞型禽流感病毒ＮＡＳＢＡ檢測方法》和《禽流感病毒ＮＡＳＢＡ檢測方

法》。

３．５　環介導逆轉錄等溫擴增技術
隨著分子生物學的發展和不斷對傳統核酸擴增技術的改進，Ｎｏｔｏｍｉ等（２０００）首先報道了一種新的核酸擴增技術，

即環介導等溫擴增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。該技術利用兩對特殊引物和有鏈置換活性的Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶，使反應中在模板兩端引物結合處循環出現環狀單鏈結構，在等溫條

件下使引物順利與模板結合并進行鏈置換擴增反應。謝青梅等（２０１０）根據ＨＡ基因保守區的序列，設計４條特異性引物進行核酸擴增，擴增后產物加入核酸染色劑ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ和４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，結果可視。擴增產物可用特異性內切酶ＫｐｎⅠ進行酶切鑒定。用已建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術檢測臨床樣品，檢測結果與ＲＴ－ＰＣＲ方法一致。ＲＴＬＡＭＰ技術整個檢測過程只需１～２ｈ，不需要ＰＣＲ儀和成像系統，僅需要恒溫水浴鍋即可完成試驗。通過特異性、敏感性試驗，驗證了建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術可以作為一種操作簡單，靈敏性、特異性高的檢測Ｈ５亞型禽流感病毒的方法。

３．６　核酸探針技術　
核酸探針技術是目前生物化學和分子生物學研究應用zui廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異性ＤＮＡ或ＲＮＡ的有力工具。

黃庚明等（２００１）利用ＰＣＲ技術建立并優化了檢測ＡＩＶ核蛋白片段（ＮＰＣ）的地高辛標記的ｃＤＮＡ探針雜交法。該探針有較好的特異性和敏感性，為從分子水平探討ＡＩ的發病機理和臨床早期快速診斷提供了新的研究手段。

４結語

目前，禽流感病毒的實驗室診斷主要從兩方面著手：①針對病原進行診斷；②針對病原產生的特異性抗體進行診斷。由于病原的特異性抗體產生時間較長，有時急性病例的家禽在瀕死前還檢測不到其特異性抗體。隨著核酸擴增技術的出現及其不斷改進，這種針對病原核酸的診斷方法具有更為準確、靈敏、特異的特點，*可用于早期快速診斷目的，并具有其自身*的優勢和廣闊的應用前景。

現代試驗診斷技術向兩個方向發展：①配備有高性能技術設備的中央檢驗，②無需特殊技術和儀器的現場快速檢驗（ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｅ　ｔｅｓｔ，ＰＯＣＴ）（楊繼瓊，２００８）。無疑對ＡＩＶ的初步篩選和鑒定可用ＰＯＣＴ方法，比如ＡＩＶ的膠體金診斷試紙條進行，這部分工作可在養殖場或疫情暴發地進行，而對于ＡＩＶ重大疫情的確診則要依靠技術設備先進的中

央檢驗來完成。隨著公眾對ＡＩＶ防制意識的加強和試驗診斷及疫苗研制技術的發展，對ＡＩＶ的早期診斷和及時治療是有可能實現的。

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