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技術文章
MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項
點擊次數：7003 發布時間：2012-11-23
MTT原理
MTT全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度在0-0.7 范圍內。
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度在0-0.7 范圍內。
MTT一般現用現配，過濾后4ºC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調pH 7.4,定容1L。
普通MTT法實驗步驟：
1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細
1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細
胞接種到96孔板，每孔體積200ul.（本人在培養時選擇1000/100ul）
2: 培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。（本人在做的時候沒有此步驟）
3：呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul.繼續孵育4 h，
2: 培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。（本人在做的時候沒有此步驟）
3：呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul.繼續孵育4 h，
終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。
每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。（本人一般24h一觀測，5~7天）
4：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為
4：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為
橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
藥物MTT法實驗步驟
貼壁細胞：
1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000-
貼壁細胞：
1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000-
10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，
2: 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，
細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午
加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，
可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
5: 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免
5: 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免
疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7: 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介
7: 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介
質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。
懸浮細胞：
1: 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培
1: 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培
養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 （儲存液100mg/ml，需預試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用
WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
5、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。
注意事項：
（1） 選擇適當得細胞接種濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔
（1） 選擇適當得細胞接種濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔
內殘余培養液。
（3） 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，
（3） 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，
zui后比色以空白調零。
（4） MTT實驗吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系。
（5） 用96孔板培養細胞做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適
根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于
DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定
（6） 一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
注意：
以上文章為轉載，本人在做試驗的時候是用的MTS方法，現做補充如下：
1.MTT VS MTS VS臺盼藍法，其實方法是次要的，IDEAzui重要，切記！
2.MTS〔3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tetrazolium,inner salt〕是一種新合成的四唑類化合物，它與MTT的應用原理相同，即被活細胞線粒體中的多種脫氫酶還原成各自有色的甲瓚產物，其顏色深淺與某些敏感細胞株的活細胞數在一定范圍內呈高度相關。其原理與MTT相似。不過MTS比MTT步驟少一步，所以可能要方便一些。
3.MTS protocol:
a：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000個細胞接種到96孔板，每孔體積100ul
b：呈色：每孔加MTS溶液20ul.繼續孵育2~4 h，（3小時為宜）
c：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
4.關于OD的選擇：上網找protocol的朋友肯定會被OD值所困擾，MTT法有的說490nm,有的570nm,我今天逛論壇的時候發現有人給出回答：MTT一般用570，MTS用490，呵呵，其實zui標準的是廠家的說明書！