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小知識:免疫組化實驗為何總出現假陽性?
閱讀：6197 發布時間：2018-5-2 近期不少客戶向恒遠生物業務員抱怨免疫組化中總出現假陽性，很是頭疼。今天小編我特意給您們找來了以往總結的經驗，希望能幫助更多的科研朋友！
1. 消除病理性色素的影響：
當所檢動物由于出血等原因造成吞噬含鐵血黃素細胞增多時，為防止其與 DAB 顯色呈現的黃褐色發生混淆，優先選用AEC顯色劑。組織固定時間過長時，切片中容易產生福爾馬林色素顆粒，影響結果觀察，取材時應充分用流水沖洗，以消除影響。
切片制作不當引起的非特異性著色 在嚴重變性、壞死及炎性病灶處，在膠原纖維和結締組織部位，在切片裱貼不平、折皺處以及組織邊緣部位常會出現非特異性著色。其中有的是因組織荷電狀態改變而吸附抗體；有的機理不明；有的可能與組織邊緣或皺折深部的槽形構型有關，解決的辦法是在滴加一抗前，以二抗動物的正常血清（ 5 %~10 %）封閉、飽和電荷吸附位點和改善取材與制片技術。
2. 清洗不充分而造成的非特異性著色：
應嚴格操作規程。緩沖液中含一定量的鹽，其有利于減低背景著色，通常使用 0.05mlo/L PBS ，溶液內加入吐溫 20 ，效果更佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。另外，在清洗后至加入下一步試劑前，不能干片，干片的部位會出現非特異著色。
DBA顯色產生的某些背景顏色 使用濃縮型 DAB 試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸鎦水的 pH 值，以確保實驗結果的正確性。粉劑 DBA 溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去。否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外， DAB 保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將 DAB 保存于避光干燥處，現用現配，臨用前加 H2O2。
3. 消除內源酶的影響：
在涉及免疫過氧化酶的各種染色中，均用過氧化物酶來標記抗體，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，正常組織中也含有一定量的過氧化物酶，其同樣也能催化底物顯色，而影響免疫組化染色的特異性，因此在加入標記酶前應設法將其滅活，以保證染色反應的特異性。
通常情況下，去除內源酶的方法是先用 3%的過氧化氫溶液作用，但在含有豐富血細胞的標本中，由于血細胞中存在大量具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫產生強烈的反應，產生氣泡而破壞組織結構和細胞形態。在 OCT 包埋的冰凍切片中，使用 3%的過氧化氫化溶液亦會產生類似現象。此時可用 3%的過氧化氫甲醇溶液孵育 20 分鐘的方法滅活內源性酶。
滅活內源酶對正確判斷含血細胞較多的標本，如骨髓、胎盤、脾等的染色結果十分重要。同樣，正常細胞也含生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應用親和素試劑的染色中，內源性生物素易結合后繼抗體，形成親和素（或鏈親合素） - 生物素復合物，導致假陽性發生。消除這種非特異性著色的方法，是在采用生物素方法染色前，對標本進行親和素處理，使其結合位點飽和。
4. 消除非特異性背景著色：
非特異性著色zui常見的情況是蛋白質（抗體）吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結締組織成分上，防止非特異性背景著色的方法之一是在滴加一抗前在標本上加一種無關的蛋白質溶液，封閉荷電點不給一抗留有吸附余地，以保證一抗不會吸附到膠原纖維及結締組織成分上。zui常用的無關蛋白質溶液是所用二抗的同種動物非免疫血清。用產生二抗的同種動物血清，是為了避免二抗與預先加入的蛋白質結合引起假陽性染色。
用來阻斷非特異性結合的血清不能有任何溶血現象。紅細胞破裂會使其中的過氧化酶與底物作用，產生非抗原特異性的陽性著色。多克隆抗體因其成分復雜，更易造成背景染色。稀釋液采用含 1%BAS pH7.4 的 PBS ，同時在洗液中加入 0.05%的吐溫 20 （ Tween20 ）有助于消除背景染色。
