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考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度的實驗方法
閱讀：2185 發布時間：2012-10-26（一）考馬斯亮蘭法實驗原理
雙縮脲法（Biuret法）和Folin―酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。
Bradford法的突出優點是：
（1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性。因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g―球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。
（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
（二）考馬斯亮蘭法試劑與器材
1. 試劑：
（1）標準蛋白質溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。
（2）考馬斯亮蘭G―250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
2. 器材：
（1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管16支
（三）考馬斯亮蘭法操作方法
1. 標準方法
（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
（2）加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
（3）用標準蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值A595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。
2. 微量法
當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍G－250試劑仍加5.0ml, 同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。