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夾心ELISA實(shí)驗(yàn)方案
閱讀：1155 發(fā)布時(shí)間：2021-9-7簡(jiǎn)介
夾心 ELISA 測(cè)定兩層抗體（捕獲抗體和檢測(cè)抗體）之間的抗原。目標(biāo)抗原必須包含至少兩個(gè)能夠結(jié)合到抗體的抗原表位。
單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統(tǒng)中用作捕獲抗體和檢測(cè)抗體。單克隆抗體識(shí)別單一表位，可對(duì)抗原中微小差別進(jìn)行定量檢測(cè)。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。
夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。
一般提示
夾心 ELISA 程序可能難以?xún)?yōu)化，應(yīng)使用已測(cè)試的匹配抗體對(duì)。這樣可確保抗體檢測(cè)靶蛋白上的不同表位，而不會(huì)干擾其它抗體結(jié)合。我們不能保證我們的抗體可用于夾心 ELISA，除非它們已經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的測(cè)試。
用捕獲抗體包被
1.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH 9.6) 中濃度為 1–10 μg/mL 的捕獲抗體包被 PVC 微量滴定板的樣品孔。
如果使用未純化抗體（例如腹水或抗血清），可能需要提高樣品蛋白質(zhì)的濃度（嘗試 用10 μg/mL）來(lái)補(bǔ)償較低濃度的特異性抗體。
2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在 4 ℃ 下孵育過(guò)夜。
3.棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μL PBS。在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
封閉和加樣
1.每孔添加 200 μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時(shí)，或在 4 ℃ 下孵育過(guò)夜。
3.用 200 µL PBS 洗滌微量滴定板兩次。
4.每孔添加 100 μL 經(jīng)過(guò)稀釋的樣品。通常將未知樣品的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)進(jìn)行比較。每個(gè)板都必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測(cè)定或三重測(cè)定）和空白樣。在 37 ℃ 下孵育 90 分鐘。
確保標(biāo)準(zhǔn)品的濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。可能需要優(yōu)化濃度范圍以確保獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品通常采取兩重測(cè)定或三重測(cè)定。
5.棄去樣品，用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次。
用檢測(cè)抗體和二抗孵育
1.每孔添加 100 μL 經(jīng)過(guò)稀釋的檢測(cè)抗體。
確保檢測(cè)抗體識(shí)別與捕獲抗體不同的靶蛋白上的表位。這能避免抗體結(jié)合受到干擾。盡可能使用已測(cè)試的匹配抗體對(duì)。
2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時(shí)。
3.用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4.添加 100 μL 偶聯(lián)二抗，其在使用之前便用封閉緩沖液進(jìn)行稀釋。
5.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 1-2 h。
6.用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
檢測(cè)
辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 分析中使用*泛的兩種酶。
要考慮到某些生物材料具有高水平的內(nèi)源酶活性（例如肺泡細(xì)胞中的高水平 ALP、紅細(xì)胞中的高水平過(guò)氧化物酶），這可能會(huì)導(dǎo)致非特異性信號(hào)。如有必要，用左旋咪唑（針對(duì) ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（針對(duì)過(guò)氧化物酶）進(jìn)行另外的阻斷處理。
ALP 底物
對(duì)硝基苯磷酸鹽 (pNPP) 是大多數(shù)應(yīng)用中廣泛使用的底物。在室溫下孵育 15-30 分鐘后，在 405 nm 處測(cè)定硝基苯酚呈現(xiàn)的黃色，加入等體積的 0.75 M NaOH 可終止反應(yīng)。
HRP 顯色液
HRP 的底物為過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯(lián)，反應(yīng)期間氫供體的氧化使顏色發(fā)生變化。
TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）
每孔添加 TMB 溶液，孵育 15–30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 處讀取光密度。
OPD（鄰苯二胺）
在 492 nm 處測(cè)定終產(chǎn)物。底物對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。
ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽）
終產(chǎn)物為綠色，可在 416 nm 處測(cè)定光密度。
某些酶底物被認(rèn)為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。
數(shù)據(jù)分析
利用系列稀釋液數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中 X 軸（對(duì)數(shù)標(biāo)度）為濃度，Y 軸（線性標(biāo)度）為吸光度。通過(guò)內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品濃度。