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基因敲除用T7E1 核酸內切酶

基因敲除用T7E1 核酸內切酶應用  

   ■ 基因突變和SNP的檢測，可應用于TALEN、CRISPR/CAS9形成的突變體檢測

   ■  識別錯配 DNA，分解四方向交叉 DNA 或分支 DNA

   ■ 檢測或切割異源二聚體 DNA 和切割 DNA

   ■ 隨機切割線性 DNA 進行 shot-gun 克隆

概述  

   T7 核酸內切酶 I 識別并切割不*配對 DNA、十字型結構 DNA、Holliday 結構或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA。該酶切割錯配堿基 5′ 端的*、第二或第三個磷酸二酯鍵。

來源  

   重組T7 核酸內切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )

反應條件

   Buffer [50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）], 即同1X NEBuffer 2，37℃溫育。

質保聲明  

   T7 核酸內切酶 I 經過嚴格的質控檢測，確保該產品具有zui高的活性和純度。請使用前務必仔細閱讀本手冊。

單位定義  

   1 單位指在50 μL反應體系，37℃，1 小時將1 μg超螺旋十字型結構的pUC（AT）質粒酶切成 90% 以上的線性DNA所需要的酶量。

注意事項  

   T7 核酸內切酶 I 是一種具有底物結構選擇性的酶。該酶以不同的活性作用于不同的 DNA 底物。切割特定底物時，必須控制酶量和反應時間。反應溫度超過 42℃時，會增加非特異性核酸酶活性。避免反應溫度超過55℃，會導致酶活性降低。

T7E1酶切法檢測突變體實驗步驟  

   1、PCR擴增目的片段：

   PCR擴增出帶有突變位點(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site) DNA片段，長度約500 bp，突變位點不位于PCR片段*，這樣將切割出兩條大小不同的帶；

   PCR反應的具體體系及條件參考實際使用的PCR聚合酶使用說明。

   2、 突變體DNA與野生型DNA的PCR產物（無需純化處理）按如下體系混合于EP管中：

   3、加熱變性、退火復性處理：

   兩種方法處理，任選其一，如下：

   I、在1L的燒杯中加入500mL水，加熱使其沸騰后，將步驟2中的EP管置于浮板上放入沸水中，停止加熱，將燒杯置于室溫，待其自然冷卻至室溫即可（此過程大約需1至1.5小時）

   II、使用PCR儀進行退火處理，設置程序如下

   95℃    5 min

   94℃    2 sec，-0.1℃/cycle, 200 times

   75℃    1 sec，-0.1℃/cycle, 600 times

   16℃    2 min

   4、T7E1酶切反應：

   上述反應體系分別加入0.5 μL T7E1酶，37℃反應30 min后，立刻加2μL DNA Loading Buffer（客戶自備），混勻后65℃煮10 min，跑2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析酶切結果。（放置時間過長可能會導致PCR產物全部降解）

 圖. 非配對內切酶法-T7E1法檢測突變體的突變率。

 突變型帶：大約300+200 bp

 野生型帶：大約500 bp

 突變率=突變型帶/(野生型帶+突變型帶)（按照帶的灰度計算）

  陽性參照  

   陽性參照是一個堿基的點突變檢測。使用本試劑盒提供陽性參照引物的混合物：

   Control-GC-F ACACCTGATCAAGCCTGTTC

   Control-GC-R CGCCAAAGAATGATCTGCG

   分別以陽性DNA Control C 和Control G為模板，PCR擴增出600bp的陽性DNA片段，點突變標示如下：

   陽性參照可以分別單獨PCR擴增后， PCR產物等量混合，或者混合DNA模板進行PCR擴增，PCR產物進行加熱變性、退火復性處理后，使用T7E1酶切，產生400bp+200bp兩個端片段。

使用限制  

   本試劑*用于科學研究。

儲存與安全  

   本品4℃運輸，儲存于-20℃，有效期12個月。長期儲存請置于-80℃。

本品采用藍冰運輸，藍冰在使用前在-80℃冷凍至少72小時。實驗證明，使用上述方法運輸，即使到貨時藍冰已經融化，泡沫塑料盒中的溫度仍然能保持在4℃或4℃以下24小時。比較干冰運輸的產品，其活性和穩定性無任何差異。產品純化整個過程都在4℃進行，且其貯存液經過優化，對保持酶活的穩定性起到重要作用。產品中含有50%甘油，可以使酶在-35℃下保持液態，若使用干冰運輸，酶將被冷凍，發生反復凍融可能會導致酶活性下降。