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免疫組化中組織及切片的處理
最近更新時間：2011-5-16
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（一） 組織處理
恰當的組織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內部因素，在組織細胞材料準備的過程中，不僅要求保持組織細胞形態完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現自溶壞死的組織，抗原已經丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區域易出現假陽性結果。
1 組織及時取材和固定
組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關鍵*步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應盡快的進行取材，2h內，取材時所用的刀應銳利，要一刀下去切開組織，不可反復切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，（也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定）。固定液快速滲透到組織內部使組織蛋白能在一定時間內迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態。
對于固定液的選擇，原則上講，應根據抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規HE病理診斷的基礎上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常規組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間在l2h內，一般固定時間不應超過24小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。
2 組織脫水、透明、浸蠟
組織經固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以*脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織*脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。
（二） 切片
組織得到很好處理后在進行切片之前還應對玻璃片進行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。
1 Poly-L-Lysine （多聚左旋賴氨酸）
一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應用，粘貼效果，但價格稍貴。
2 明膠硫酸鉻鉀法
將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，*溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。
3 APES （3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）
此法必須現用現配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現氣泡。
切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現假陽性現象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而產生抗原標記定位彌漫現象。
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