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綠色熒光蛋白-用途

最近更新時間：2011-5-5

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www.xldjsj.com/st175729/product_4537662.html在細胞生物學與分子生物學領域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個報導基因（reporter gene）。一些經修飾過的型式可作為生物探針，綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物（例如:兔子上進行表現，并拿來映證某種假設的實驗方法。

1．分子標記
作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學的許多研究領域得到應用。利用綠色熒光蛋白*的發光機制，可將GFP作為蛋白質標簽（protein tagging），即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。由于GFP相對較小，只有238個氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發光功能，利用GFP的這一特性已經加深了我們對細胞內一些過程的了解，如細胞分裂、染色體復制和分裂，發育和信號轉導等。1996年，Ehrdardt等人報道了利用GFP的特性研究細胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細胞分裂位點形成了一個環狀物，且至少有9種蛋白在細胞分裂中起重要作用，盡管對這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP來檢測目標蛋白的定位已為我們提供了一種對細胞內的一些基本的生理過程進行更詳盡觀察的新方法。
除用于特定蛋白的標記定位外，GFP亦大量用于各種細胞器的標記如細胞骨架、質膜、細胞核等等。Shi等人曾報道將GFP融合到大腸桿菌細胞膜表面用作標記蛋白，這一技術將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構建細胞生物傳感器用作環境檢測以及探測信號轉導過程等等。這些都為傳統生物學研究提供了新思路和新方法，成為交叉學科研究的熱點。
2．藥物篩選
許多新發展的光學分析方法已經開始利用活體細胞來進行藥物篩選，這一技術能從數量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基于細胞的熒光分析可分為三類：即根據熒光的密度變化、能量轉移或熒光探針的分布來研究目標蛋白如受體、離子通道或酶的狀態的變化。熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針。
在細胞體內分子之間的相互作用非常復雜，其中很多涉及到信號分子在細胞器之間的遷移。例如當信號分子和某一特殊受體結合后常會導致配體-受體復合物從某一細胞區域遷移到另一區域，而這一遷移過程通常會介導一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號分子相似的能引起配體一受體復合物遷移并介導生理反應的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經成功構建了一個篩選模型用于研究藥物介導的糖皮質激素受體（hGR）的遷移過程。在一96孔板中培養細胞，并以一編碼hGR GFP蛋白的質粒轉染該細胞。當細胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細胞質遷移人細胞核的過程可實時或在某一時段內被證實，根據熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進行藥物篩選由于受其必須與遷移的信號分子相偶聯，其篩選容量相對較低，但是由于GFP在細胞內的穿透性強及*的發光機制，因而在藥物篩選中具有相當大的應用潛力。

3．融合抗體
近二十年來，抗體生成技術有了飛速發展，已經從細胞工程抗體（雜交瘤技術一單克隆抗體）發展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術的出現，解決了人源抗體的研制問題，促進了各種性能優良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發。單鏈抗體（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得較多的一種小分子抗體，其*陛在于可在宿主細胞內大量表達，易于基因工程操作，尤其易于構建抗體融合蛋白。近年來，關于綠色熒光蛋白融合單鏈抗體的報道很多，國內也有相關報道，如程虹等報道將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合GFP真核表達載體并導人小鼠成纖維細胞NIH3T3表達并獲得成功。因融合抗體具有與抗原結合及發射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應用于流式細胞儀和免疫熒光的標記及腫瘤的檢測等等。
由于技術上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達系統如E.coli中表達。為便于表達蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標蛋白。但這一技術也存在一些問題。由于抗體分子內存在二硫鍵，而在原核表達系統內由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達出來的目標蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進行復性。但近來也有報道在動物細胞細胞質中成功表達出具有抗原結合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達問題，則在免疫染色及腫瘤檢測這一領域融合抗體將扮演極為重要的角色。
4．生物傳感器
蛋白質工程技術已經開始采用將一具有信號傳導功能分子識別位點的分子結合到另一分子上來設計生物感受器。綠色熒光蛋白由于其*的光信號傳導機制，以及在表達后易被周圍化學環境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細胞體內的光學感受器。*個基于GFP的生物感受器為Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時提出。這一感受器原理是利用鈣調蛋白結合鈣離子后引起的空間構象變化導致兩種GFP突變體間發生熒光共振能量轉移。但是由于大多數蛋白不能像鈣調蛋白那樣承受較大的空間構象變化，為克服這一缺點，人們開始提出利用基因融合技術將一新的分子識別位點結合到GFP上以構建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據這一原理將TEM1 β-內酰胺酶（Bla）融合到GFP上。當缺少目標分子時，GFP處于靜止狀態不會產生熒光。但是當目標分子β-內酰胺酶抑制蛋白（BLIP）與Bla結合后，即使GFP活化產生熒光，而這一變化很容易被檢測到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術已經成為構建分子感受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應用前景極為廣闊。

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