氯霉素快速檢測試劑盒說明書
一、氯霉素檢測試劑盒說明書原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條 上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氯霉素抗體，加入 酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氯霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
- 樣本檢測下限
蛋類、牛奶
（方法一）····························· 0.1 ppb 尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.05ppb 組織、肝臟、蜂蜜、牛奶
（方法二）············· 0.025ppb
- 交叉反應率
氯霉素· ······································· 100%
甲砜霉素 ······································ < 0.1%
氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%
樣本回收率
組織、肝臟 ································ | 85%±20% | ||
蜂蜜、腸衣 ································ | 83%±25% | ||
牛奶、飼料 ································ | 75%±23% | ||
尿液、血清 ································ | 70%±18% | ||
三、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
（1ml/瓶） | |||
| 1.35ppb | 4.05ppb | |
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3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
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4 | 抗體濃縮液 | 1ml | 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵qing化鈉、
葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、
硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實 驗結果。
樣本前處理需配制：
配液 1 C 液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵qing化鈉加去離子水 100ml 溶解。
配液 2 D 液（牛奶、奶粉樣本）：
28.8g 硫酸鋅加去離子水 100ml 溶解。 配液 3 pH4.8 100mM 醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱 2.4g 醋酸鈉和 1.2ml 醋酸加去離子水500ml 溶解混合。
配液 4 乙腈-水溶液：
V 乙腈：VH2O＝84：16
配液 5 樣本復溶液：將 2X 濃縮復溶液用去離子水按 1：1 稀釋。
| (1 份濃縮復溶掖+1 份去離子水，用于抗體 | 氮氣流下干燥；用 0.5ml 樣本復溶液溶解干燥 | |
| 的稀釋和樣本提取后的復溶)。 | 的殘留物，混合 30s； | |
u | 樣本處理： | 3、 取 50 µl 用于分析。 |
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（a）組織、肝臟樣本處理方法 | 樣本稀釋倍數： 0.5 倍 | ||
1、 稱取均質后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中， | 檢測下限：0.025ppb | 定量下限：0.1 ppb | |
| 先加入 3ml 去離子水混勻后再加入 6ml 乙酸乙 | 注：我們推薦 0.1 ppb 為陽性樣本的 cut off 值。 | |
| 酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min； | （e）腸衣處理方法 |
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2、 取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干； | 1、 用均質器均質樣本；注：干樣本需剪碎（長度 | ||
3、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml | 不超 5mm）后再均質，濕樣本需用去離子水漂 | ||
| 樣本復溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 | 洗 20min 以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質； | |
| 5min；去除上層有機相； | 2、 稱 1±0.05g 均質后的樣本于 50ml 離心管中，加 | |
4、 取 50 µl 下層相用于分析。 | 入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min | ||
| 樣本稀釋倍數: 0.5 倍 | 以上離心 10min； |
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（b）血清血漿處理方法 | 3、 取 5ml 上層液體（相當于 0.5g 的樣本）在氮氣 | ||
1、 取 1ml 血清或血漿至試管中，加 2ml 乙酸乙酯 | 流下 50-60℃干燥； |
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| 振蕩 1min；靜置使水相與有機相分層或室溫 | 4、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 0.5ml | |
| 4000r/min 離心 5min； | 樣本復溶液振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上 | |
2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流 | 離心 5min；除上層有機相； | ||
| 50℃水浴中干燥；殘留物用 1 ml 樣本復溶液溶 | 5、 取下層 50 µl 用于分析。 | |
| 解，混合 30s； | 樣本稀釋倍數： 1 倍 |
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3、 取 50 µl 下層相用于分析。 | （f）牛奶樣本處理方法一 |
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| 樣本稀釋倍數: 1 倍 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | |
（c） 尿液處理方法 | 理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | ||
1、 移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋 | 至 50ml 離心管中，加入 150µl C 液出現沉淀， | ||
| 酸鈉緩沖液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶 | 短暫振蕩后加入 150µl D 液混合； | |
| (Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在 37℃ | 2、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液； | |
| 水解至少 2 小時（或過夜）； | 用樣本復溶液以等體積稀釋上層液，混合 30s； | |
2、 該溶液恢復至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯混合 | 3、 取 50µl 用于分析。 |
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| 1min；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml | 注：如果離心后仍然渾濁，再重復沉淀過程。 | |
| 上層液體在氮氣下 50～60℃干燥； | 樣本稀釋倍數：2 |
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3、 用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合 | 檢測下限：0.1ppb | 定量下限：0.15ppb | |
| 30s； | （g）牛奶樣本處理方法二 |
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4、 取 50µl 用于分析。 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | ||
| 樣本稀釋倍數: 1 倍 | 理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | |
（d）蜂蜜處理方法 | 至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D | ||
1、 取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 4ml 去離 | 液*混合，4-12℃4000r/min 以上離心 10min。 | ||
| 子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min，室溫 | 如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃； | |
| 4000r/min 以上離心 10min； | 2、 轉移出 2.2ml 上層液（相當于 2ml 奶樣）至新 | |
2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃ | 的離心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min； | ||
室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min ； 3、 吸取2ml 乙酸乙酯上層液體（相當于1ml 奶樣），
50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.5ml 樣本復溶 液溶解干燥的殘留物，混合 30s；
4、 取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數：0.5
檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb
由于陰性樣本可能會產生背景干擾 （在某些 情況下干擾數值在標準 2 到 3 之間），所以推 薦標準 3 作為陽性結果的 CUT OFF 判斷值。
（h）奶粉樣本處理方法
1、 稱 2±0.05 g 奶粉至 50ml 離心管中，加入 10ml去離子水振蕩溶解；加入 1ml C 液和 1ml D 液*混合；4-12℃4000r/min 以上離心 10min。若無冷凍離心機，請預先將樣本冷卻到 8℃；
2、 轉移出 3.6ml 上層液（相當于 0.6g 奶粉）至新 的離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5min；室 溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min；
3、 吸取 4ml 乙酸乙酯上層液體（相當于 0.4g 奶 粉），50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.4ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合 30s；
4、 取 50 µl 用于分析。
樣本稀釋倍數：1
檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb
由于陰性樣本可能會產生背景干擾 （在某些情況下干擾數值在標準 2 到 3 之間），所以推薦 標準 3 作為陽性結果的 CUT OFF 判斷值。
（i）蛋類處理方法
1、 稱取 3±0.05 g 均質的樣本，加入 9ml 乙腈-水溶 液振蕩 2min，15℃4000r/min 以上離心 10min；
2、 取 3ml 上層相與 3ml 去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合 1min，15℃4000r/min 以上離心 10min；取上層有機相置 50-60℃下氮氣 流吹干；
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物后，用 2ml 樣本復 溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去除上層有機相；
4、 取 50 µl 用于分析。
樣本稀釋倍數：
| 檢測下限：0.1ppb | 定量檢測限：0.3ppb | 7、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 | ||||
（j）飼料處理方法 |
| 洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 | |||||
1、 稱取 2±0.05g 均質過的飼料樣本，加入 2ml 去 | 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 | ||||||
| 離子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min， | 破）。 |
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| 15℃ 4000r/min 以上離心 10min； | 8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃ | |||||
2、 取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹干； | 環境中反應 30min。將孔內液體甩干，用洗滌 | ||||||
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物，用 1ml 樣本復溶 | 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍 | ||||||
| 液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去 | 干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 | |||||
| 除上層有機相； |
| 9、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B | ||||
4、 取 50 µl 用于分析。 |
| 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯 | |||||
| 樣本稀釋倍數：1 |
| 色 15min。 |
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六、 酶標免疫分析程序: |
| 10、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻， | |||||
| 設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/63 | ||||||
u | 測定前應須知： |
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| 0nm 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。 | ||||||
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 | |||||||
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| （20～25℃）。 |
| 七、結果判定 |
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2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 | 結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方 | ||||||
3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于 | 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與 | ||||||
| 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 | 其所含氯霉素量成負相關。 |
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| 程序中的要點。 |
| 1、粗略判定： |
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4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 | 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出 | ||||||
| 蓋住微孔板。 |
| 其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3， | ||||
u | 操作步驟： |
| 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是： | ||||
1、 從 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～ | 0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415； | ||||||
| 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使 | 0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。 | |||||
| 用前均須搖勻。 |
| 則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2 | ||||
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放 | 的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀 | ||||||
| 入自封袋，保存于 2-8℃。 | 釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度。 | |||||
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 | 2、定量分析 |
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| 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 | （1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 | |||||
| 去離子水），或按所需用量配制洗滌液。 | 吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 | |||||
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每 | 孔）除以*個標準（0 標準）的吸光度值，再乘 | ||||||
| 個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和 | 以 100%，即 |
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| 樣本孔所在的位置。 |
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| B |
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5、 將濃縮抗體用樣本復溶液 11 倍稀釋（1 份抗體 | 百分吸光率（%）＝ | ×100% | |||||
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加入 10 份稀釋液，按需配制使用） | B0 | ||||||
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 | |||||||
6、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 | |||||||
B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值 | |||||||
加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕 | |||||||
（2）標準曲線的繪制與計算 | |||||||
振蕩混勻。25℃環境中反應 30min。 | |||||||
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| 以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準 | ||||||
品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線 圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準 曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋 倍數即為樣本中氯霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于 大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會 伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。 所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質 和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴 露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標 準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能 變質。
8、 該試劑盒*反應溫度為 25℃，溫度過高或過 低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見 包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正 常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
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