作為后基因組時代出現的新興研究領域之一, 蛋白質組學(proteomics)正受到越來越多的關注。 蛋白質組學的研究目標是對機體或細胞的所有蛋白質進行鑒定和結構功能分析。 蛋白質組學的研究不局限任何特定的方法。 高分辨率的蛋白質分離技術如二維凝膠電泳和液相層析, 經典的蛋白質鑒定方法如氨基酸序列分析等, 現代質譜技術, 基因組學研究的各種手段, 現代計算機信息學和計算機網絡通訊技術等等, 任何可用于蛋白質研究的技術手段, 蛋白質組學都可能會采用。 它體現的是一個開放的思維和研究方式。
蛋白質-蛋白質的相互作用是細胞生命活動的基礎和特征。 這種千變萬化的相互作用以及由此形成的紛繁復雜的蛋白質網絡同樣也是蛋白質組學的研究內容, 相應的工作也已經開展。
酵母雙雜交系統(yeast two-hybrid system)自建立以來已經成為分析蛋白質相互作用的強有力的方法之一。 該方法在不斷完善, 如今它不但可用來在體內檢驗蛋白質間的相互作用, 而且還能用來發現新的作用蛋白質, 在對蛋白質組中特定的代謝途徑中蛋白質相互作用關系網絡的認識上發揮了重要的作用。 實驗表明雙雜交技術在蛋白質組學上的應用是成功的。 本文將就雙雜交技術的產生、發展及其在蛋白質組研究方面的初步應用作一介紹。
一、蛋白質組學的產生背景
基因組研究自從開展以來已經取得了舉世矚目的成就。 在過去幾年中, 已經陸續完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結構比較簡單的生物的基因組DNA的全序列分析［1］。 線蟲(C.elegans)的基因組DNA測序工作已基本完成［2］。 規模更為龐大的人類基因組計劃預期在下一世紀的前幾年(2003～2005年)也將完成全部基因組DNA的序列分析。 這些進展是非常令人振奮的。 但是也隨之產生了新問題。 大量涌出的新基因數據迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質有什么功能這個問題。 不僅如此, 在細胞合成蛋白質之后, 這些蛋白質往往還要經歷翻譯后的加工修飾。 也就是說, 一個基因對應的不是一種蛋白質而可能是幾種甚至是數十種。 包容了數千甚至數萬種蛋白質的細胞是如何運轉的？或者說這些蛋白質在細胞內是怎樣工作、如何相互作用、相互協調的？這些問題遠不是基因組研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白質組學(proteomics)應運而生。
蛋白質組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(Marc Wilkins)先提出來的［3］, 早見諸于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上［4］, 它是指一個有機體的全部蛋白質組成及其活動方式。 蛋白質組研究雖然尚處于初始階段, 但已經取得了一些重要進展。 當前蛋白質組學的主要內容是, 在建立和發展蛋白質組研究的技術方法的同時, 進行蛋白質組分析。 對蛋白質組的分析工作大致有兩個方面。 一方面, 通過二維凝膠電泳得到正常生理條件下的機體、組織或細胞的全部蛋白質的圖譜, 相關數據將作為待檢測機體、組織或細胞的二維參考圖譜和數據庫。 一系列這樣的二維參考圖譜和數據庫已經建立并且可通過聯網檢索。 二維參考圖譜建立的意義在于為進一步的分析工作提供基礎。 蛋白質組分析的另一方面, 是比較分析在變化了的生理條件下蛋白質組所發生的變化。 如蛋白質表達量的變化, 翻譯后修飾的變化, 或者可能的條件下分析蛋白質在亞細胞水平上的定位的改變等。 關于蛋白質組學的介紹可參閱文獻［5,6］。
細胞或組織的蛋白質不是雜亂無章的混合物, 蛋白質間的相互作用、相互協調是細胞進行一切代謝活動的基礎。 蛋白質間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質組研究所面臨的問題。 研究蛋白質間的相互作用有多種方法, 常用的如酵母雙雜交系統、親和層析、免疫沉淀、蛋白質交聯等。 其中, 酵母雙雜交系統是當前發展迅速、應用廣泛的主要方法。
二、酵母雙雜交系統的建立與發展
雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。 細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。 80年代的工作表明, 轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成, 其中有DNA結合結構域(DNA binding domain, 簡稱為DB)和轉錄激活結構域(activation domain, 簡稱為AD), 它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結合, 但是不能激活轉錄。 而不同轉錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。 如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄［7］。
Fields等人的工作標志雙雜交系統的正式建立［8］。 他們以與調控SUC2基因有關的兩個蛋白質Snf1和Snf2為模型, 將前者與Gal4的DB結構域融合, 另外一個與Gal4的AD結構域的酸性區域融合。 由DB和AD形成的融合蛋白現在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用, 那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉錄激活因子, 從而激活相應基因的轉錄與表達。 這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因(reporter gene)。 通過對報道基因表達產物的檢測, 反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質之間是否存在相互作用。 在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因, 并且在該基因的上游調控區引入受Gal4蛋白調控的GAL1序列。 這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負調控因子)被缺失, 從而排除了細胞內源調控因子的影響。 已經知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。 結果發現只有同時轉化了Snf1和Snf2融合表達載體的酵母細胞才有β-半乳糖苷酶活性, 單獨轉化其中任何一個載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。
目前發展起來的各種雙雜交系統大多是以Fields等人建立的系統為基礎的。 這些新系統主要對報道基因、“誘餌”表達載體以及“獵物”表達載體等做了一些改進。 其中一個重要改進是引入額外的報道基因, 如廣泛采用的HIS3基因。 經過改造帶有HIS3報道基因的酵母細胞, 只有當HIS3被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養基上生長。 HIS3報道基因的轉錄表達是由“誘餌”和“獵物”的相互作用所啟動的。 大多數雙雜交系統往往同時使用兩個甚至三個報道基因, 其中之一是LacZ。 這些改造后的基因在啟動子區有相同的轉錄激活因子結合位點, 因此可以被相同的轉錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。 通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現象。 其他還有針對“誘餌”或“獵物”表達載體等所作的改進, 這里不一一詳述。
在雙雜交鑒定過程中要經過兩次轉化, 這個工作量是相當大的, 特別是尋找新的作用蛋白質的時候尤其如此。 而且, 酵母細胞的轉化效率比細菌要低約4個數量級。 因此轉化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。 Bendixen等人通過酵母接合型的引用, 避免了兩次轉化操作, 同時又提高了雙雜交的效率［9］。 在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型： a接合型和α接合型, 這兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體, 但a接合型細胞之間或α接合型細胞之間不能接合形成二倍體。 根據酵母有性生殖的這一特點, 他們將文庫質粒轉化α接合型酵母細胞, “誘餌”表達載體轉化a接合型細胞。 然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔(lawn), 再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上, 原則上只有誘餌和靶蛋白發生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。 單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。 長出來的克隆進一步通過β-半乳糖苷酶活力進行鑒定。 這項改進不僅簡化了實驗操作, 而且也提高了雙雜交的篩選效率。
在研究蛋白質的結構功能特點、作用方式過程中, 有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質間的相互作用。 針對實際工作中的這種需要, Vidal等人發展了所謂的逆雙雜交系統(reverse two-hybrid system)［10,11］。 這項技術的關鍵是報道基因URA3的引入。 URA3基因在這里起到了反選擇的作用, 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。 該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉化成對細胞有毒的物質。 Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內引入Gal4的結合位點。 這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。 在含有5-FOA的*培養基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。 然而如果目的蛋白, 即與DB或AD融合的蛋白質發生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用, URA3基因不表達, 則細胞能在含有5-FOA的*培養基上生長。 通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉錄因子E2F1的突變物, 這些突變物仍然能結合視網膜母細胞瘤蛋白RB, 但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結合能力。 結果得到了體外結合實驗的驗證。 通過對這些突變蛋白基因的測序, 他們發現了新的E2F1同DP1結合的位點。
以上介紹的酵母雙雜交系統都是建立在對RNA聚合酶II的激活的基礎上的。 這意味著雙雜交過程是在細胞核內完成的。 然而許多待研究的蛋白質是膜蛋白, 它們需定位到膜上之后才能表現正常的生物功能，與其他蛋白質起作用。 有些真核細胞蛋白還要經過翻譯后的加工修飾如二硫鍵的形成、糖基化、聚異戊二烯基化等。 這些加工修飾在正常的細胞核內不可能發生。 有些蛋白質本身具有激活轉錄的活性, 它們可不經過雙雜交相互作用即能激活報道基因的表達。 因此根據需要有人又發展了新的雙雜交系統。 例如, Aronheim等人設計了一個Sos蛋白介導的雙雜交系統［12］, 也被作者稱為Sos救活系統(Sos recruitment system)。 人的鳥苷酸交換因子-Sos蛋白是一種胞質蛋白, 而酵母的鳥苷酸交換因子-cdc25蛋白定位在內膜上, 可將相關受體信號傳導給Ras蛋白。 由cdc25突變產生的一種溫度敏感突變型細胞不能在36 ℃條件下生長。 但是, 如果Sos蛋白可以通過某種方式被定位到酵母細胞內膜上, 那么它在這種溫度敏感突變型細胞中因替代cdc25蛋白的作用, 而使酵母恢復在36 ℃條件下生長的能力。 在Aronheim等人設計的系統中, 待研究的兩個蛋白質分別與豆蔻酰基化信號片段和Sos蛋白融合, 前一個融合蛋白定位于膜上, 如果兩個待研究蛋白質之間存在相互作用, 這將使Sos也定位到膜上, 從而可激活Ras蛋白使酵母在36 ℃下生長。 利用該技術Aronheim等人找到了c-Jun的兩個新的作用伙伴。
此外還有其他類型的雙雜交甚至三雜交系統, 本文不再詳述。
三、雙雜交系統在蛋白質組研究中的應用
雙雜交系統在蛋白質組研究上的應用可以說尚處于嘗試階段, 這方面的文獻報道還很少, 但已顯示其在分析鑒定細胞內復雜的蛋白質相互作用方面的潛力。 這里以兩家實驗室的工作為例作一介紹。
Fromont-Racine等人［13,14］以10種功能已知的與mRNA前體剪接有關的蛋白質作起始“誘餌”, 從含有約5×106個克隆的釀酒酵母基因組文庫中進行*輪篩選(這些基因組DNA與AD的基因融合構成“獵物”表達載體)。 經過對陽性克隆“獵物”DNA的序列分析, 他們把這些DNA分成兩大類共5項(圖1)： 編碼蛋白質的DNA和非編碼蛋白質的DNA, 前一類分為四項： A1是在序列上彼此有部分重疊的克隆群。 這一項也是首先分析考慮的對象； A2和A3分別是靠近ORF起始密碼子的編碼蛋白質N-末端的片段和ORF內部的大編碼片段, A4是其他的編碼序列。 這四項優先考慮的順序是： A1>A2>A3>A4。 根據分析把從中得到的4種靶蛋白做成新的“誘餌”進行第二輪篩選。 再把從中得到的一種“獵物”做成“誘餌”進行第三輪篩選。 如此經過三輪共十五次篩選, 他們從中共得到約700個陽性克隆并且對大多數作了部分測序。 這些篩選到的靶蛋白中, 有9種是已知的mRNA前體剪接因子, 5種是新發現的剪接因子, 8種是與RNA其他加工過程有關的因子, 還有45種與其他的功能有關。 另外有9種是轉錄激活因子, 這主要來自假陽性克隆。 他們不僅發現了已知剪接因子與其他因子的相互作用, 鑒定了一些新的因子, 而且建立了這個剪接途徑與其他代謝途徑的。
據此Fromont-Racine等人聲稱, 如果選擇不同的細胞代謝或信號轉導途徑為出發點, 通過類似的雙雜交實驗終有可能建立酵母細胞完整的蛋白質圖譜。 推而廣之, 這項技術同樣也能用到人類蛋白質組研究中。 Fromont-Racine等人能在較短的時間完成如此大量的篩選、分析工作, 一個非常關鍵的因素是他們采用了上述Bendixen等人建立的通過酵母的有性接合得到雙雜交菌株, 并且對此技術作了進一步的改進。 Bendixen等人是通過把兩種接合型細胞同時復印到一個平板上使之接合；而Fromont-Racine則是把兩種細胞直接在濾膜上混合然后鋪到選擇性平板上, 因此避免了煩瑣的復印操作, 使工作效率進一步有所提高［13］。
與此類似, Hudson等人也正在進行釀酒酵母的蛋白質組的研究分析工作［14］。 他們把酵母所有的即約6 000多種蛋白質開放讀碼框(ORF)，分別構建成與DB和AD基因融合的表達載體。 兩類載體分別轉化不同接合型酵母菌株。 6 000株分別表達不同的AD-ORF即“獵物”的細胞在16張384孔微滴定板上培養, 再取少許菌液點在只表達一種BD融合蛋白的細胞形成的菌苔上使兩種細胞接合形成二倍體, 然后按照常規的雙雜交技術鑒定“誘餌”和AD融合蛋白是否發生相互作用(圖2)。 整個過程主要是在384孔微滴定板上完成的。 和Fromont-Racine等人的方法相比, 這個方法的優點是操作過程可大程度地自動化, 微滴定板的使用也大大提高了處理量。 這項工作雖已由Frederickson作了介紹, 但目前為止尚未見到它正式發表。 根據Frederi-ckson的評論, 這個方法如果成功的話, 那末它很有可能在人類蛋白質組研究中得到應用。
四、結束語
酵母雙雜交技術問世不到十年, 但已經在蛋白質間的相互作用研究、篩選新的蛋白質、研究蛋白質的功能等諸方面發揮重要作用。 雙雜交技術固然有其內在的不足之處, 如通過雙雜交觀察到的蛋白質的相互作用在真實情況下不一定發生, 也即所謂的假陽性； 假陰性現象也是雙雜交分析過程中經常碰到的問題； 一些對細胞致命的蛋白質也不適宜通過雙雜交系統來分析。 雙雜交只是反映蛋白質間能發生作用的可能性, 這種可能還必須經過其他實驗驗證, 尤其要與生理功能研究相結合, 否則可能會誤入歧途。 雖然如此, 該技術已經成為許多實驗室研究蛋白質的相互作用和蛋白質的結構與功能的必要手段。 技術的發展與創新、研究成果的迅速共享為建立有機體的全部蛋白質(蛋白質組組分)的相互作用及其功能關系圖譜提供了基礎和條件。 我們不奢望通過雙雜交系統能發現所有真實的蛋白質相互作用, 但在沒有更好的方法問世之前, 雙雜交技術仍是開展這類研究的有力工具。
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