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CLEM：整合光學(xué)電子顯微鏡優(yōu)勢(shì)
近年來(lái)，光學(xué)顯微鏡研究以活細(xì)胞成像為主導(dǎo)，而電子顯微鏡則被用于高分辨率研究。后來(lái)，人們逐漸有意將這兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)。整合之后的成果叫做光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（CLEM）。電子顯微鏡提供的高分辨率使樣本制備過(guò)程中的人工產(chǎn)物同樣清晰可見(jiàn)。新版Leica EM ICE是一款帶有快速傳輸系統(tǒng)的高壓冷凍儀，允許光鏡電鏡相關(guān)實(shí)驗(yàn)，能夠完好保存超微結(jié)構(gòu)，避免出現(xiàn)此類人工產(chǎn)物。
20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的綠色熒光蛋白（GFP）激發(fā)了人們此后對(duì)活細(xì)胞成像研究的濃厚興趣。而顯微鏡上配備的更快捷、更靈敏的檢測(cè)裝置則讓這種研究興趣愈發(fā)濃厚。生命科學(xué)從這些活細(xì)胞成像研究中獲取了大量的研究成果，很難想象要是沒(méi)有這些用具，生命科學(xué)將走向何種地步。
電子顯微鏡領(lǐng)域并未緊跟光學(xué)顯微鏡掀起的研究熱潮，但近年來(lái)有跡象表明光學(xué)顯微鏡的分辨率有時(shí)給人們解答科學(xué)疑問(wèn)帶來(lái)了局限性。因此，人們愈發(fā)有意開(kāi)發(fā)能將綠色熒光蛋白的活細(xì)胞成像功能和電鏡的高分辨率有效結(jié)合的新技術(shù)（見(jiàn)圖1）。綠色熒光蛋白在電鏡（電子顯微鏡）中并非直接可見(jiàn)，但可以通過(guò)抗體或光轉(zhuǎn)化顯現(xiàn)。
但這類方法只能用于在室溫下化學(xué)固定的樣本。有明確記錄表明這種做法會(huì)引入人工產(chǎn)物。這些人工產(chǎn)物在光鏡（光學(xué)顯微鏡）下不可見(jiàn)，原因可能是缺少固定劑（實(shí)時(shí)），或者在研究固定樣本時(shí)人工產(chǎn)物不在光鏡的分辨率范圍內(nèi)。
然而人工產(chǎn)物在電鏡下則顯而易見(jiàn)，這種成像能力正是我們?cè)谘芯砍⒔Y(jié)構(gòu)時(shí)需要的高分辨率和精確細(xì)節(jié)。另外一種依靠物理固定的方法叫做冷凍固定。這種方法能更快固定細(xì)胞，并且和化學(xué)固定不同，這種方法并非選擇性固定。高壓冷凍（HPF）如今是冷凍固定細(xì)胞和組織可靠的方法。將樣本置于高壓下（2,000bar），數(shù)毫秒后在樣品上噴灑液氮。這樣做能避免冰晶形成和擴(kuò)散，并立即固定樣本，形成厚度可達(dá)200至300微米保存完好的玻璃化樣本。
圖1：某CLEM實(shí)驗(yàn)圖解模型在現(xiàn)代CLEM實(shí)驗(yàn)中，首先將樣本（綠色細(xì)胞）置于光學(xué)顯微鏡下實(shí)時(shí)研究。可以跟蹤觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（按箭頭）。當(dāng)出現(xiàn)有意思的現(xiàn)象時(shí)，將樣本固定，并進(jìn)行電子顯微鏡觀察處理。將同一個(gè)細(xì)胞置于電子顯微鏡下追溯（灰色圖像），便可在高分辨率下研究感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和現(xiàn)象。
具備高時(shí)間分辨率的高壓冷凍技術(shù)
圖2：Leica EM PACT2左（新版Leica EM ICE右） 高壓冷凍儀適用于標(biāo)準(zhǔn)高壓冷凍和光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)。操作非常簡(jiǎn)便：只需插入快速樣品托，剩下的就交給儀器搞定。
高壓冷凍設(shè)備最初并非是為這些類型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的，主要的限制在于在光鏡下研究樣本、發(fā)現(xiàn)特殊的稀有現(xiàn)象并將樣本轉(zhuǎn)移到高壓冷凍設(shè)備進(jìn)行固定這一過(guò)程所需的時(shí)間。對(duì)一名老練的技術(shù)員來(lái)說(shuō)，這一過(guò)程至少需要30秒以上。到那時(shí)，想要觀察的結(jié)構(gòu)可能早已發(fā)生變化或者消失（見(jiàn)圖1）。
于是，徠卡顯微系統(tǒng)聯(lián)手來(lái)自英國(guó)布里斯托沃克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Paul Verkade博士著手開(kāi)發(fā)一種能夠進(jìn)行光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)支持高壓冷凍技術(shù)且時(shí)間分辨率少于5秒的儀器。這項(xiàng)開(kāi)發(fā)成果便是Leica EM PACT2 /新版Leica EM ICE（見(jiàn)圖2）。該儀器可自由移動(dòng)，能移動(dòng)到任何光學(xué)顯微鏡所在位置。RTS指的是快速傳輸系統(tǒng)該系統(tǒng)由快速樣品托和傳輸系統(tǒng)本體組成，快速裝載機(jī)用于裝載樣品（見(jiàn)圖3），傳輸系統(tǒng)本體則固定在高壓冷凍設(shè)備上。待快速樣品托插入快速傳輸系統(tǒng)后，樣本被自動(dòng)圍住，并沿軌道快速傳送至內(nèi)部進(jìn)行冷凍。這個(gè)過(guò)程僅需2.4秒。這讓科學(xué)家有足夠時(shí)間將快速樣品托從光學(xué)顯微鏡下取出并放入快速傳輸系統(tǒng)。這一動(dòng)作可在1至1.5秒內(nèi)輕松完成，繼而將時(shí)間分辨率總體維持在4-5秒左右。然后便可對(duì)冷凍樣品做電子顯微鏡觀察處理。
冷凍替換標(biāo)準(zhǔn)
多數(shù)情況下，這一過(guò)程會(huì)涉及冷凍替換。冷凍替換是指清除樣品中的冷凍水和丙酮等溶劑，然后在低溫下進(jìn)行樹(shù)脂滲透和聚合。為此，徠卡顯微系統(tǒng)近期推出了配備EM FSP的Leica EM AFS2，它能自動(dòng)替換所有冷凍替代化學(xué)物，簡(jiǎn)化科學(xué)家的工作。圖3是該實(shí)驗(yàn)示例。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與量子點(diǎn)偶聯(lián)。量子點(diǎn)能產(chǎn)生熒光且電子密度高，是光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)研究中非常好用的標(biāo)記。表皮生長(zhǎng)因子內(nèi)化30分鐘后出現(xiàn)在多泡體（MVB）中。多泡體以動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，具有許多延伸部分并隨時(shí)間顯現(xiàn)和消失（見(jiàn)圖3c）。
圖3：使用高壓冷凍進(jìn)行光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)，先在光學(xué)顯微鏡下研究感興趣的細(xì)胞。在該細(xì)胞的DIC圖像上覆上紅色熒光量子點(diǎn)（見(jiàn)圖3a）。將感興趣的結(jié)構(gòu)包裹并實(shí)時(shí)跟蹤觀察。拍攝熒光圖像，顯示最后10秒序列（見(jiàn)圖3c）。在0秒時(shí)，取出快速樣品托放入快速傳輸系統(tǒng)。對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行冷凍和處理后，對(duì)其進(jìn)行追溯（比較圖3a和3b）。
當(dāng)觀察到另一延伸部分出現(xiàn)時(shí)，取走樣本并立即進(jìn)行冷凍。對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行追溯便可在高分辨率下看見(jiàn)感興趣的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。總之，Leica EM PACT2或者新版Leica EM ICE搭配徠卡顯微顯微鏡為生命科學(xué)家提供了優(yōu)秀的解決方案，既豐富了他們的研究手段又有助于擴(kuò)展他們的學(xué)識(shí)。