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高通量蛋白質穩定性分析DSF

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Applied Photophysics Ltd. (APL)


 

英國Applied Photophysics Ltd(英國應用光物理公司上海代表處)是專業科學儀器研發制造公司, 圓二色CD光譜儀、停流stopped flow 反應動力學分析儀、激光閃解Laser Flash Photolysis 分析儀(瞬態吸收光譜儀) 等廣泛應用于分子空間結構與構象、分子間相互作用、快速反應動力學分析等領域的研究,特別是生物大分子之間、生物大分子與有機小分子如藥物、各類手性化合物等的結構與相互作用的研究。


Chirascan 系列圓二色CD光譜儀為靜態圓二色光譜分析樹立了新的標準,采用多種新技術、新設計,使光強度達到大,特別是遠紫外區。它的先進、精密的數字式數據采集系統可實現快速、準確的光譜采集。


包括和可配置多種功能模塊(吸收absorbance 、熒光Fluoresence 、全熒光譜、線二色(LD) 、熒光探測圓二色(FDCD) 、同步三維熒光CCD檢測 、熒光偏振各向異性譜FP ( Fluoresence Polarization )、熒光圓二色CPL ( 圓偏振發光) 、磁CD(MCD )、ORD (旋光色散)、低溫檢測附件、滴定系統、固態粉末樣品的透射法檢測、漫反射法積分球檢測裝置、停流Stopped flow 系統等)、CPL圓偏振發光等檢測附件,以使各種研究目的都能得到高標準高質量的、可靠的、可驗證的結果數據。有大量高水平的科研論文和基礎研究成果的數據出自本系列儀器。


在藥物研發、藥物篩選等基礎應用研究上是常用的基本的研究工具,業界熟悉的制藥公司如Amgen 、GSK, 阿斯利康AstraZeneca 、諾和諾德、禮萊Eli Lilly 、羅氏Roche , 健贊Genzyme 、BMS、Riverside 等均有多臺本系列儀器在各個研究組發揮著重要的作用。

 

英國 Applied Photophysics( 應用光物理) 生產的型號為 Chirascan 系列的圓色CD(circular dichroism) 光譜儀,在國內的清華大學 (目前6套) 、北京大學(目前2套)、武漢大學(目前2套)、四川大學(目前3套) 、中山大學(目前3套) 、華南理工大學(目前3套)、山東大學(目前2套)、復旦大學(2套) 、上海科技大學(2套)、中科院生物物理所、中科院化學所、中科院微生物所(目前3套) 、中科院上海藥物研究所、中科院上海有機所、中科院上海應用物理研究所、中科院上海生化細胞所、中科院上海巴斯德研究所、中科院武漢病毒所、中科院物理數學研究所、中科院蘇州納米所、中科院寧波材料所 、中科院廣州生物醫藥與健康研究院、中國食品藥品檢驗研究院、上海藥明康德制藥、上海中科新生命生物技術公司、上海恒瑞制藥、上海復宏漢霖制藥、上海三生國健制藥、北京神州細胞生物技術公司、深圳翰宇制藥、山東新時代制藥等的實驗室有很好的應用,并有很好的影響因子的文獻引用和發表。


CD圓二色光譜儀 Chirascan , Chirascan-plus, Chirascan VX , Chirascan V100,, Chirascan Q100 Circular Dichroism Spectrometers


Chirascan and Chirascan-plus, Chirascan V100  are the world's most advanced circular dichroism (CD) spectrometers. They are widely used in the study of the higher structures of bio-macromolecules, such as proteins and DNA, and how these structures change on interaction with other molecular entities. Their many innovative features provide the scientist with easy-to-use, productive tools that deliver circular dichroism spectra of a quality and on a timescale that has until recently been impossible.

停流(stopped flow技術,用于研究溶液體系的非常快速的反應的動力學機理,反應的時間一般在0.001秒到秒時間量級,通過研究瞬時反應動力學現象可反映反應的速度、機理、短時間存在過的反應中間過渡態等基礎信息。


英國 Applied Photophysics Ltd ( 應用光物理公司) 生產的型號為 SX20 系列的停流光譜儀,以及之前的系列如SX 18 MV, SX 17 , SX 15 , SX 12 等,數據引用率占可檢索到的已發表的文獻的八成以上。


可選擇配置的功能模塊為:時間分辨的吸收分析、二級管陣列檢測器PDA 、雙熒光檢測、熒光偏振FP (Fluoresence Polarization )檢測,多通道序列混合系統、淬滅停流(Quench Flow ) 檢測、電化學檢測,及CD圓二色停流分析系統等。


SX20 停流光譜儀 SX20 Stopped-Flow Spectrometer

The SX20 is the latest in the SX range of stopped-flow reaction analysers from Applied Photophysics and is used to study transient and pre-steady-state kinetics of fast, liquid-phase reactions. The SX range has, since its introduction over 15 years ago, established itself as the first choice of those involved in stopped-flow kinetic research. The SX20 and its predecessors offer unrivalled performance, as well as a host of upgrade opportunities for the detailed investigation of chemical and biochemical reaction mechanisms.



RX.2000 快速混合停流裝置,可與多種型號的紫外可見分光光度計(如Agilent 8453, 8454 , 瓦里安 Cary  50,100, 300 , 3000等)、熒光光譜儀(如日立 Hitachi 熒光 F-4000, F-4500, F-4600, F-7000等各型號熒光光譜儀, 瓦里安系列熒光光譜儀、PE各型號熒光光譜儀等)、CD光譜儀聯用,研究毫秒時間量級的快速動力學反應。小巧方便,經濟適用。


RX.2000 Rapid Mixing Stopped-Flow Unit

The RX.2000 provides the means to measure stopped-flow rapid reaction kinetics using any UV-visible spectrometer, fluorometer or CD spectropolarimeter. This high performance, cost effective unit enables reactions to be studied that are at least a thousand fold faster than those accessible manually.



在蓬勃發展的生物制藥領域:

英國應用光物理公司 Applied Photophysics Ltd ,做為專業的圓二色CD光譜儀和停流光譜儀儀器制造商,Chirascan 系列圓二色CD光譜儀是分析生物大分子如蛋白質、DNA 、多肽等的高級結構(二級結構, 三級結構)的經典方法, 在國內外的生物制藥領域廣泛應用, Chirascan 系列圓二色光譜儀在圓二色檢測的精確度、準確度等方面相比傳統圓二色儀器都有了革命性的提高, 從而大大擴展了圓二色光譜CD的應用, 特別是在生物制藥行業的高級結構表征、高級結構相似性比較研究 ,配套符合FDA行業指南的數據統計學分析方法及軟件便于業內人士的數據處理和分析。大量的同行業用戶, 便于數據的互相比對互相核驗、評估和互相認可。

與生物制藥行業的發展與時俱進, 英國應用光物理公司 Applied Photophysics推出了蛋白質化學穩定性分析解決方案 SUPR-CM ,用于篩選合適的蛋白質濃度,從而更快地篩選formulation或者藥物候選體篩選,其快速( 384孔板, 2.5分鐘掃描一塊板)、自動化、高通量 ,高靈敏度高質量的數據(CCD 熒光檢測), 可以設置 任意incubation 時間如24小時, 48小時, 甚至更長(不同于目前市場上局限于2小時內等)等*的技術設計,受到業內人士的歡迎。

圓二色光譜儀,停流stopped flow光譜儀,激光光解光譜儀,動力學分析儀

應用領域 綜合
  蛋白質穩定性
 
  蛋白質穩定性是生物技術藥物重要的關鍵質量屬性之一,它決定了生物藥物的藥效、生產可行性、安全性及保質期。蛋白質高級結構穩定性確保了蛋白質在其貨架壽命期內保持活性和安全。
 
  穩定性研究被用來確認蛋白質在不同條件下高級結構HOS(High Order Structure)的穩定性,如溫度、pH值、輔料成分及儲存時間等,以確定適宜的存儲和運輸條件。同時,監管機構如FDA、EMA等在授權生物藥使用批準之前也要求廣泛的穩定性數據。因此,理解和確保治療性蛋白質藥物的高級結構穩定性是生物制藥企業開發安全有效藥物的必要條件,研究人員需要在研發和生產的多個階段對蛋白質高級結構穩定性進行分析和評估。
 
  蛋白質穩定性的常見分析方法
 
  蛋白質的穩定性分析通常會使用以下方法進行研究:
 
  生化方法
 
  圓二色譜(CD,Circular Dichroism Spectroscopy)
 
  差示掃描量熱法(DSC)
 
  定量PCR(qPCR)技術(外源熒光DSF)
 
  動態光散射(DLS)與靜態光散射(SLS)方法
 
  差示掃描量熱法(DSC)法常常被做為蛋白質穩定性分析最重要的的解決方案,然而,由于對儲存于微孔板(如96或384孔板)上的大量樣品的快速分析需求,使得DSC在藥物篩選和早期開發中的應用受到一定的限制。因此,DSF(內源熒光法)已成為一種流行且具有成本效益的解決方案。
 
  DSF(內源熒光法)無需對待測樣品進行任何標記,也無需使用任何熒光探針,即可快速測量整塊樣品微孔板,并提供高通量數據以幫助樣品候選物和配方成分的篩選。
 
  DSF法快速篩選大量樣品,大大提高了藥物篩選、成藥性分析的效率,分析結果與DSC技術互相正交驗證。對很多生物技術藥物而言,利用DSF方法做為快速大量篩選,使用DSC技術來正交驗證DSF的早篩結果,是藥物篩選和藥物開發的一個有效方案。
 
  DSF技術原理:
 
  
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
  差示掃描熒光法(DSF)是一種經濟高效且易于使用的生物物理技術,它通過檢測當溫度升高或變性劑存在時熒光發射光譜的相應變化來確定蛋白質的變性轉變溫度(熱轉變溫度Tm值或化學變性Cm值)。
 
  研究發現,蛋白質分子中芳香環氨基酸在處于不同極性的微環境時(如疏水或親水環境中),其被激發的內源熒光的最大發射光譜會發生位移。蛋白質中內源熒光主要來自含芳香環氨基酸如色氨酸(Trp),苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr),其中以色氨酸內源熒光強。
 
  以色氨酸為例,在蛋白質疏水的內核微環境中,其內源熒光最大發射波長在330nm左右,而在親水的極性微環境中,色氨酸的內源熒光最大發射波長則出現在350nm左右。蛋白質熱變性或者化學變性通常會導致色氨酸殘基周圍微環境的極性發生變化,使通常被包埋于蛋白質疏水內核的色氨酸逐漸暴露于親水的環境中,從而導致內源熒光最大發射波長發生紅移(Red Shift),即向更大的波長區域移動。
 
  這種監測色氨酸內源熒光變化的方法無需熒光探針或者標簽,避免了傳統外源熒光DSF中背景熒光以及非特異吸附等假陽性結果。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
  當蛋白質由于熱變性或者化學變性劑(如鹽酸胍、尿素等)作用而發生去折疊時,測量內源熒光隨溫度或者變性劑的變化來就可以研究蛋白質的展開過程。這些變化的數據可以用于生成熔解曲線,并獲取表觀熱轉變溫度Tm值、Tonset、范德華焓變(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)、化學變性Cm值等用于蛋白質穩定性的評估和預測。
 
  傳統DSF經常使用350/330比值法來進行數據分析,而SUPR-DSF提供了多種分析方法,除了比值法外,SUPR-DSF還提供了BCM(Barycentric mean,質心均值法),可以得到比350/330比值法更好的信噪比,同時更有利于低濃度蛋白樣品的分析。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
高通量蛋白質穩定性分析DSF系統主要特點:
 
  采用標準的384微孔板,無需特殊的耗材和毛細管
 
  高通量篩選,一個升溫過程(60-80分鐘)內可完成
 
  單塊384微孔板的測試利用內源熒光,無需染料或標簽,兼容常用生物體系UV LED激發配合全光譜檢測
 
  僅需要10-30μl樣品,樣品濃度0.05~250mg/mL
 
  獲得關鍵參數:Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及親和力等
 
  提供嚴謹的數據質量和可重復性
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
SUPR-DSF系統的應用:
 
  SUPR-DSF系統廣泛應用于生命科學基礎研究和藥物研發等多個領域:
 
  加速突變體的篩選
 
  配方和預配方的篩選和優化
 
  蛋白結晶條件篩選
 
  批間一致性評估
 
  生物相似性評估
 
  加速應力和強制降解研究
 
  結合誘導的構象變化分析
 
  翻譯后修飾評估
 
  恒溫和化學穩定性分析
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
高通量蛋白質穩定性分析DSF系統的技術規格:
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
典型應用案例--加速突變體的篩選
 
  使用SUPR-DSF對16個樣品進行比較和篩選,其中包括1個野生型蛋白(WT)和15個單點突變體。在1.5小時內,DSF儀器生成了48個樣本(每組3次重復)的高質量熔解曲線(相同時間內最多可生成384孔的數據)。用模型對數據進行擬合,可獲取熔解溫度Tm值并對穩定性進行排序和篩選。
 
  如圖1所示,與WT(藍色)相比,其中3個突變體(9、13和14)的熔解曲線左移,說明其蛋白穩定性降低;余下12個突變體的穩定性均有所提高。其中,突變體1、8和12的穩定性提升最大。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
  圖2展示了幾個代表性樣本的熔解曲線,可以發現一些蛋白質發生了單一熱轉變過程(WT蛋白與突變體7和8),而另一些蛋白質(突變體1和14)則清楚地顯示出兩段熱轉變過程,即熔解曲線上有兩個拐點。通過SUPR-DSF提供的數據,可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進行深入研究。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
精確解析單抗的Fab區域
 
  使用SUPR-DSF獲得NISTmAb(NIST單抗標準品)的差示掃描熒光數據,并將結果與差示掃描量熱法(DSC)所獲得的數據進行比較。SUPR-DSF可以解析NISTmAb所有的三個結構域:CH2(69°C),CH3(83°C),和Fab區域(94°C)。SUPR-DSF的最高掃描溫度為105°C,可以精確測量異常穩定的Fab區域熔解溫度,而其他DSF平臺的掃描最高溫度一般僅為95°C,容易丟失單抗Fab區域去折疊變性的重要信息(圖5(a))。
 
  將SUPR-DSF歸一化后的數據與DSC結果進行比較。如圖5(b)所示,三個峰相互匹配,證明了兩種技術良好的一致性,使用SUPR-DSF可以輕松獲得高質量的蛋白質穩定性信息。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
典型應用案例--加速曲妥珠單抗的輔料和配方篩選
 
  生物治療藥物如抗體等的配方是保證藥效、生產可行性和安全性的基礎,也決定了儲存和運輸的條件。制藥企業亟需高通量的方法來快速可靠地篩選大量的條件組合,以確定最佳配方。
 
  使用SUPR-DSF,研究者對治療性抗體曲妥珠單抗在96種不同條件下的穩定性進行了篩選和分析,并在1.5小時內完成了測試。測試結果與差示掃描量熱法(DSC)的結果非常一致。如果集成實驗室自動化設備,每天可以完成數千個樣品的篩選。
 
  DSF熔解曲線顯示出兩個獨立的轉變區域,通過最小二乘法對數據進行擬合,可以確定Tonset值、Tm值和范德華焓變(△H)。圖3(a,b)分別展示了破壞/增強穩定性的輔料的熔解曲線及擬合圖。圖4(a)列出了能夠提高抗體穩定性的所有輔料(與對照樣品相比)。
 
  SUPR-DSF正確鑒別了已上市的曲妥珠單抗中使用的輔料組氨酸和海藻糖的穩定性作用,如圖4(b)所示,SUPRDSF數據具有出色的可靠性和一致性,同時提供驚人的高通量。
 
利用高通量差示掃描熒光法獲得結合參數
 
  結合分析研究是藥物研發的一個關鍵領域,相互作用的特征和KD值(解離平衡常數,表征分子間結合的親和力)對候選物的選擇是至關重要的,研究者需要采用多種原理互補的方法來篩選和確定文庫中的數千種至數萬種小分子化合物。
 
  通過SUPR-DSF進行分子相互作用分析,不受表面效應、物質遷移(mass transport)或緩沖液折光率問題等因素的影響,可在分析物結合濃度范圍內提供高通量、無需標記的測量。
 
  通過檢測蛋白質-配體復合物的穩定性變化,可用于確認結合的特異性;通過熱變性時熒光發射光譜的變化和配體濃度的函數關系可以計算KD值。即使對于非常弱的結合分子,結合所誘導的穩定性變化也能被SUPR-DSF檢測到。
 
  使用標準384微孔板,能夠在一天內篩選數千個樣品的穩定性,從而確認結合狀態。
 
  使用SUPR-DSF研究配體(TFMSA)與人碳酸酐酶I的結合作用,碳酸酐酶隨TFMSA濃度變化的熔解曲線如圖6所示。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
  圖7顯示了人碳酸酐酶I的Tm值與TFMSA濃度的關系,擬合所獲得的KD值有兩個,分別為2.1μM和174.2μM,與
 
  文獻中的數值一致,證明SUPR-DSF可以用作配體結合研究的預篩選或確認工具,并且具有靈敏度。
 
高通量蛋白質穩定性分析DSF
直觀簡明的軟件
 
  SUPR-DSF軟件提供直觀、簡潔、智能、高效的實驗設計與數據分析功能,既可以讓初學者快速上手,又可為經驗豐富的資深用戶提供多種進階選項。
 
關于ProteinStable
 
  為Applied Photophysics的子公司,旨在將以客戶為中心的技術引入蛋白質篩選和表征市場,重點是高通量、低樣品量的蛋白質表征方法,在不影響數據質量的條件下提高生產力。
 
  關于AppliedPhotophysics
 
  英國應用光物理公司Applied Photophysics數十年來為生物藥的結構與功能研究提供專業方案,產品包括圓二色CD光譜儀、停流stopped flow反應動力學分析儀、SUPR DSF蛋白質穩定性分析儀
 
  等。用戶遍布各大高校和科研機構和全球的制藥公司。
 
  Chirascan系列圓二色CD光譜儀,廣泛應用于蛋白質等生物藥的高級結構表征,包括蛋白質等的二級結構、三級結構分析,以及二級結構熱穩定性、三級結構的熱穩定性研究。
 

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