產品信息

產品描述
 

全血直接PCR試劑盒是一款可以直接對全血樣本進行PCR擴增的試劑盒，無需DNA提取或樣品處理，大大降低了污染風險，縮短了檢測時間。

試劑盒中包含配方優化的2× Blood Master Mix，具有很強抑制物耐受性，人血的模板大加入量可達45%，鼠血的可達20%，可以靈敏的擴增血液樣本中基因組和外源目的DNA篇段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，擴增產物末端加A，適用于Hieff Clone®快速克隆試劑盒（貨號：10907ES60/10908ES60）。

該試劑盒可用于直接擴增的血樣類型包括：新鮮血液、4℃貯存血液、冷凍血液以及儲存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干xue漬，且兼容所有常規抗凝劑（EDTA、檸檬酸鹽、肝素等）。適用樣本來源包括人血、鼠血、雞血、鳥血、牛血、狗血等。

產品組分
 

a）2× Blood Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反應增強劑、優化劑以及穩定劑等，產品已混合溴酚藍染料（不含SDS），PCR產物可以直接進行電泳。

運輸和保存方法
 

冰袋運輸。-20℃保存。避免反復凍融。

操作方法
 

1. PCR反應體系配制
 

【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
   a）模板使用量：進行基因組上的目的片段檢測，建議使用少量的血液量作為模板；檢測血液樣本中某種病毒或細菌等的目的片段，建議擴大PCR體系并使用較大量的血液模板。血液模板多占PCR體系的45%（人血）、20%（鼠血）。若模板使用含有血液的采集卡，可截取直徑1-4 mm的血點，直接加入20-50 μL PCR反應體系進行擴增。

b）引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-0.5 μM之間進行調整。

c）反應體系：推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。

2. PCR反應條件設置
 

【注】： a）預變性：95℃，5 min可以讓白細胞裂解，釋放可用于PCR擴增的基因組DNA。請勿縮短時間或降低溫度。

b）退火溫度：退火溫度設置為引物Tm值即可。然而，使用高的退火溫度可以有效減少非特異性擴增，并提高全血模板的擴增效率。因此，如擴增產物特異性較差，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板適退火溫度。

c）延伸時間：按30 sec/kb設定，如不足30 sec，設置30 sec即可。

d）擴增循環數：35個循環已可以擴增足量產物。太多的循環將會導致非特異性擴增增加。

3. 擴增產物分析
 

PCR完成后，建議將反應液于1000× g (大約4000 rpm) 離心1～3 min以沉淀血細胞碎片，之后取上清進行下游分析。該步驟可有效去除多種血液組分。當使用高濃度血液模板時此步尤為重要，因為經過PCR循環，反應管中會存在大量的血細胞碎片。這些碎片會干擾下游的檢測，如瓊脂糖電泳檢測。注意：由于血液本身的原因，PCR 結束后在 PCR 管的底部會出現透明凝膠狀物質，此為正常現象。

4. 對照反應
 

在PCR結果分析時，不管是陽性結果或陰性結果，如果沒有對照反應，都不能確定結果是否可靠。為了便于后續實驗結果的分析，建議在進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。

4.1 陽性對照反應體系
 

【注】：a）模板DNA：選用樣本純化的DNA。

 b）引物的選擇：建議選擇該樣本較易擴增的基因的引物，如 β-actin 基因或 GAPDH 等。

4.2 陰性對照
 

PCR反應體系被污染會導致PCR結果出現假陽性，需要設置陰性對照來排除。將使用的移液器槍頭浸泡在2× Blood Master Mix中，添加引物，ddH2O進行PCR擴增；另取ddH2O作為模板，用目的基因引物進行PCR擴增，以排除PCR體系是否被污染和實驗是否有其他污染源。

注意事項
 

1. 盡量使用新鮮抗凝血。若凍存血，應避免反復凍融。

2. 解凍后2× Blood Master Mix可能出現渾濁，冰上放置1-2 min，待溶液澄清后，上下顛倒混勻，不影響試劑性能。
3. 建議擴增片段長度1 kb以內，以便擴增效率*。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題與解決方法
 

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