多肽合成技術(shù)
多肽化學(xué)合成的基本介紹
多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用BOC和Z兩種保護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對(duì)與固相合成，具有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合成主要缺點(diǎn)是，合成范圍小，一般都集中在10個(gè)氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對(duì)中間體進(jìn)行提純，時(shí)間長(zhǎng)，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用FMOC和BOC兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且可以比較容易的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。
1.1．氨基酸保護(hù)基
20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以*定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù)，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。
表1 常見3種氨基脫除條件

圖1 常見3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu)
氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣，固相中BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請(qǐng)參考王德心的《固相有機(jī)合成——原理及應(yīng)用指南》第四章，我們這里主要介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護(hù)基及其脫除方法。Cys常見的保護(hù)基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個(gè)保護(hù)基可以完成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。Lys常見的保護(hù)基有：Boc，F(xiàn)moc，Trt，Dde，Allyl，這對(duì)于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。Asp常見的保護(hù)基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。
表2 巰基常見保護(hù)基

表3 氨基常見保護(hù)基

表3 羧基常見保護(hù)基

1.2．多肽縮合試劑

目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng)，早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對(duì)稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。
1.2.1．碳二亞胺型
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。EDC.HCl因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當(dāng)成功。但是該類型的縮合試劑的一個(gè)大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使用，會(huì)有比較多的副反應(yīng)，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機(jī)理如下：

圖2  DIC活化反應(yīng)機(jī)理
1.2.2．鎓鹽型
鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：

圖3  TBTU活化反應(yīng)機(jī)理
1.3．多肽合成方法比較
1.3.1．液相多肽合成（solution phase synthesis）
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。

圖4液相合成Glu-Trp
1.3.2．固相多肽合成

圖5  FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中，需要反復(fù)使用TFA脫BOC，而且在后從樹脂上切割下來需要使用HF，由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，而且切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，因此現(xiàn)在使用受到實(shí)驗(yàn)條件限制，使用也逐漸減少。FMOC方法反應(yīng)條件溫和，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用。
1.3.2.1．固相合成中常用樹脂
固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是1%，因?yàn)檫@種交聯(lián)度下，樹脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動(dòng)。樹脂中關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因?yàn)槠鋵?duì)酸非常穩(wěn)定，需要在HF，TFMSA等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來。

圖6  固相合成常用樹脂
1.3.2.2．茚三酮檢測(cè)
固相多肽合成中，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：
A，6% 茚三酮的乙醇溶液
B，80% 苯酚的乙醇溶液
C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接*。
還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，***法，溴芬蘭法等。

圖7 茚三酮檢測(cè)原理
1.3.2.3．固相合成切割方法
固相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后經(jīng)過冰**沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過HPLC分離純化，冷凍干燥得到后產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時(shí)候，選擇的切割方法也不*相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對(duì)于PAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割，切割過程中需要添加對(duì)甲苯酚，對(duì)巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對(duì)于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對(duì)部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。
1.3.3．多肽合成中主要問題
1.3.3.1．消旋及其反應(yīng)機(jī)理
多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會(huì)導(dǎo)致不同程度的消旋，特別容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對(duì)于這些氨基酸，可以通過采用高效縮合試劑，減少反應(yīng)時(shí)間，可以減少消旋的比例，一般條件選擇適當(dāng)，消旋化都可以控制在5%以內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：

圖8 消旋反應(yīng)機(jī)理
1.3.3.2．二酮**（DKP）反應(yīng)
DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現(xiàn)在個(gè)氨基酸為Pro的時(shí)候，當(dāng)?shù)诙€(gè)氨基酸脫FMOC的時(shí)候，α-氨基被游離出來之后，立即對(duì)Wang樹脂的芐酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮**衍生物，同時(shí)從Wang樹脂上釋放出來，導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)非常迅速，文獻(xiàn)報(bào)道采用50%Pip/DMF，脫1min，4min的條件，但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)情況下，即使是1min左右反應(yīng)就超過了20%。因此一般在末端個(gè)氨基酸為Pro的時(shí)候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由于該樹脂巨大的空間阻力，可以*消除該副反應(yīng)。這個(gè)副反應(yīng)在BOC策略合成過程中，卻可以*避免，因?yàn)锽OC在使用TFA脫除后，使氨基以TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進(jìn)攻芐酯鍵。

圖9  DKP反應(yīng)機(jī)理
1.3.3.3．困難序列多肽合成
固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬?beta;-折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道使用的主要方法有：

使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液
提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法
使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。
使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時(shí)減少樹脂擔(dān)載量（0.05-0.2mmol/g）
1.4．合成多肽分析鑒定方法
多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等方法。
1.4.1．純度分析
多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動(dòng)相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時(shí)間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。
1.4.2．一級(jí)結(jié)構(gòu)分析
1.4.2.1．質(zhì)譜分析
質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量，當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常會(huì)給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數(shù)目有關(guān)，因此，經(jīng)常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長(zhǎng)肽或蛋白過程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高靈敏度，所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰，分別對(duì)應(yīng)：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。
1.4.2.2．氨基酸組成分析
氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃，用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)樘於０泛凸劝滨０返膫?cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測(cè)定，要精確測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
1.4.2.3．氨基酸序列分析
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個(gè)過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三***處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反應(yīng)液中萃取出來，而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程，整個(gè)測(cè)序過程現(xiàn)在都是通過測(cè)序儀自動(dòng)進(jìn)行。
1.4.3．二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
1.4.3.1．圓二色譜（CD）
圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它通過測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-240nm），主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長(zhǎng)范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。α-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。β-折疊構(gòu)象的CD譜，在217-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。
1.4.3.2．核磁共振(NMR)
隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構(gòu)象。目前，NMR在分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的，分析結(jié)果快速準(zhǔn)確。
1.4.3.3．X-衍射
X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對(duì)與構(gòu)型。

多肽標(biāo)記及修飾
目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué)，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13，H2），熒光標(biāo)記（FAM，F(xiàn)ITC），生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。
2.1．非放射性核素標(biāo)記
目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因?yàn)槠涫褂冒踩派湫孕　，F(xiàn)在有比較*的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。
2.2．熒光標(biāo)記
熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。因此，目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對(duì)于FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一個(gè)氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA切割掉。
2.3．生物素標(biāo)記
生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對(duì)硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS常用，當(dāng)然，也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。
2.4．磷酸肽合成
磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或長(zhǎng)肽的時(shí)候，連接效率低，后產(chǎn)品純度很低，對(duì)于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷酰基，完成反應(yīng)。

蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽
多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時(shí)候，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu)，多肽類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或提高生物活性，同時(shí)也為了改變多肽的穩(wěn)定性，提高其抗酶解能力。
3.1．α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中為普通的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無規(guī)卷曲的，目前使用多的方法是多肽保持α-螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過共價(jià)鍵將處在α-螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)氨基酸連接起來，選擇的位點(diǎn)（i，i+4或i，i+7），選擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵，硫醚鍵，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等方法。
3.1.1．二硫鍵
二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個(gè)Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，可以通過Ellman檢測(cè)以及HPLC檢測(cè)方法對(duì)其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
3.1.2．硫醚鍵
硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys，將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，利用其和巰基的特異性反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行，迅速高效。
3.1.3．酰胺鍵
多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用Lys，Asp（Glu）的選擇性保護(hù)，在固相上直接環(huán)化。BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm），F(xiàn)MOC策略中可以采用FMOC-Lys（Aloc），F(xiàn)MOC-Asp（Allyl）。對(duì)于首尾環(huán)肽，還可以先合成保護(hù)的多肽，然后在液相中環(huán)化生成目標(biāo)多肽。
3.1.4．烯烴鍵（RCM）
RCM反應(yīng)是一個(gè)過渡金屬催化反應(yīng)，其反應(yīng)中使用催化劑：(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh，可以催化烯烴環(huán)化，過程中脫去一分子乙烯。

圖10  固相RCM反應(yīng)
該反應(yīng)也可以在固相樹脂上直接環(huán)化,反應(yīng)條件：15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃，24-48h。
3.2．TASP（template-assembled synthetic peptide）多肽
瑞士Basel大學(xué)的化學(xué)家*提出TASP的概念，他們利用具有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的肽鏈作為模板，然后將具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽直接連接到模板上，模擬蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。
3.3．長(zhǎng)肽或蛋白合成
3.3.1．FMOC-tbu片段縮合方法
FMOC-tbu片段縮合方法在合成長(zhǎng)肽以及蛋白上面運(yùn)用非常廣泛，其合成過程首先是合成保護(hù)性肽片段，經(jīng)過純化后，將幾個(gè)片段在液相或固相上組裝起來。使用本方法主要注意幾個(gè)方面：片段的選擇，片段的合成與純化，片段縮合方法。片段選擇要考慮到片段連接反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，容易導(dǎo)致消旋，故片段的C末端好選擇Gly，Pro。合成的片段一般需要經(jīng)過C4，C8等純化，對(duì)于溶解性很差的多肽，可以采用硅膠柱層析方法進(jìn)行純化。由于片段的分子大，在樹脂內(nèi)移動(dòng)速度慢，故反應(yīng)時(shí)間一般都很長(zhǎng)，而且反應(yīng)過程中與片段濃度關(guān)系很大，溶解的時(shí)候，盡量提高片段的濃度。對(duì)多種條件的選擇，發(fā)現(xiàn)采用DMF為溶劑，DIC/HOBt的方法縮合效率高，消旋也小。

圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖
3.3.2．自然化學(xué)連接（Native Chemical Ligation）
自然化學(xué)連接方法的優(yōu)點(diǎn)是可以采用*脫保護(hù)的多肽，因此不存在溶解性問題，其反應(yīng)也是在緩沖水溶液中進(jìn)行，由于其利用的是巰基和硫酯的特異性反應(yīng)，再經(jīng)過由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成。

圖13自然化學(xué)連接
總之，今后多肽化學(xué)的研究，不僅是將更多的有機(jī)化學(xué)合成新方法，新技術(shù)引入到多肽研究當(dāng)中，而且對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能模擬，開展結(jié)構(gòu)活性研究（structure activity relationship）將是研究開發(fā)的熱點(diǎn)，因?yàn)檫@將為揭示蛋白的內(nèi)在的生物活性本質(zhì)提供大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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